基于Sleeping Beauty转座子系统快速构建不同基因型乙型肝炎病毒稳定整合细胞株方法的研究

摘要

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是全球范围内的重要公共卫生问题。HBV为嗜肝病毒，只能在肝细胞中增殖，目前HBV复制与抑制相关的研究大多采用HBV质粒瞬时转染Huh7或HepG2细胞的方法，但在进行药物筛查、病毒制备等需要稳定均一的实验条件时，稳定整合细胞株是更好的选择。HepG2.2.15和HepAD38是当前用于HBV研究的最常用的两株细胞株，其构建策略为随机整合方式，且这两株细胞株均为Genotype D型。有研究表明，不同基因型乙型肝炎病毒有不同的地理分布特征，在复制、感染、耐药、突变等方面有所差异，对于疾病的进展、治疗应答和预后转归有不同的提示意义，因此在综合全面研究HBV时，需要对不同基因型的HBV进行评价。
　　Sleeping Beauty转座子是一种高效稳定的基因转移工具，它能通过“剪切-粘贴”的方式将外源目的基因整合入宿主细胞基因组中，国内外尚无利用Sleeping Beauty转座子构建HBV稳定整合细胞株的报道。本研究设计搭建了一种新型的携带Sleeping Beauty转座子（包括ITRs正反向重复序列和SB100X转座酶元件）、荧光报告基因(mCherry)、真核抗性基因（Puro嘌呤霉素）的ALL-IN-ONE载体并命名为pTsmP。从临床血清样本中提取了不同基因型的HBV序列连入pTsmP载体中，构建筛选了不同基因型的稳定整合乙型肝炎病毒细胞株，最终选取了最为常见的GenotypeA、B、C、D四型细胞株进行后续研究，Southern/Northern Blot、CLEIA检测与间接免疫荧光检测结果表明经过数十代传代培养，不同基因型的细胞株均稳定复制转录且在一定范围内稳定表达HBsAg、HBeAg和HBcAg等病毒蛋白。恩替卡韦(Entecavir，ETV)体外药物阻断试验结果显示，所制备的四型HBV均对ETV有较好的敏感性。
　　综上所述，本研究成功设计了基于Sleeping Beauty转座子系统快速构建不同基因型HBV稳定整合细胞株的方法，并验证了其可行性。此研究为HBV细胞株的构建和乙型肝炎病毒的制备方法提供思路，为HBV复制、感染等相关研究提供更加全面稳定的实验工具。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

一、乙型肝炎病毒

1 乙型肝炎病毒的病原学

2 乙型肝炎病毒感染

3 乙型肝炎病毒的基因型

二、Sleeping Beauty转座子

1 Sleeping Beauty Transposon的起源和发展

2 Sleeping Beauty Transposon的结构

3 Sleeping Beauty Transposon的机制

三、本研究的思路、目的及意义

1 pTsmP-HBV1．3质粒的构建

2 pTsmP-HBV1．3细胞株的构建

第二章 材料与方法

1 材料

2 方法

第三章 结果与分析

1 pTsmP-HBV1．3质粒构建

2 细胞株构建

3 细胞株评价，功能性验证

第四章 讨论

1 pTsmP-HBV1．3质粒的构建

2 细胞株构建

3 细胞株评价

第五章 小结与展望

参考文献

在校期间的科研成果

致谢