利用可示踪转基因斑马鱼研究原始造血和定向造血的关系及斑马鱼细胞移植方法的建立

摘要

目的：本课题利用已建立的可示踪的转基因斑马鱼系 TG（zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EGFP)和TG(zC-myb:EGFP)，通过实时跟踪观察，从而动态观测原始造血干细胞和定向造血干细胞的迁移过程，以期了解斑马鱼原始造血和定向造血的关系，为进一步研究斑马鱼血液系统发育提供可能的理论依据。
　　方法：分别收集红色荧光蛋白（DsRed）标记原始造血干细胞的转基因系 TG（zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EGFP)和绿色荧光蛋白（EGFP）标记定向造血干细胞的转基因斑马鱼系TG(zC-myb:EGFP)自交和侧交的斑马鱼胚胎，于12hpf(hours post-fertilization，hpf)去卵膜，进行局部麻醉，利用激光共聚焦显微镜对全胚胎进行连续实时的动态扫描,从12hpf开始观察，直至48hpf,期间每隔两小时拍摄一次进行追踪观察。
　　结果：（1）红色荧光蛋白（DsRed）标记原始造血干细胞的转基因系 TG（zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EGFP)自交后，观察胚胎发现lmo2+的细胞在14hpf开始表达红色荧光，主要表达的部位是在斑马鱼胚胎的头部中胚层（anterior paraxial mesoderm,ALM），随后在中间细胞群（intermediate cell mass,ICM）表达；18-22hpf发现红色荧光标记的lmo2+的细胞在ICM区表达逐渐增强，24hpf达到高峰,30hpf在尾部造血组织（caudal hematopoietic tissue，CHT）开始表达，持续至48hpf。（2）绿色荧光蛋白（EGFP）标记定向造血干细胞的转基因斑马鱼系TG(zC-myb:EGFP)自交后，观察绿色荧光标记的c-myb+的细胞,24hpf开始表达，最初表达的部位是PBI（posterior bloodisland，PBI）区，随后在28hpf表达逐渐增强，并沿着AGM区向原肾导管迁移，28hpf在PBI区和AGM区的表达逐渐增强，持续到36hpf；此外发现在28hpf斑马鱼的头部和胸腺有少量c-myb+细胞的存在;32-36hpf PBI区、AGM区和头部的c-myb+细胞逐渐增多；42-48hpf在斑马鱼头部 c-myb+细胞逐渐减少（3） TG(zLmo2:Loxp-DsRed-Loxp-EGFP：TG(zC-myb:EGFP)侧交的斑马鱼胚胎，观察发现受精后24小时可以看到PBI区有少量的又红又绿的lmo2+和c-myb+的双阳性细胞和红色的lmo2+的细胞；26hpf PBI区lmo2+和c-myb+双阳性细胞逐渐增多，28hpf lmo2+和c-myb+双阳性细胞在PBI区逐渐增多并向主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros，AGM）迁移，30-38hpf lmo2+和c-myb+双阳性细胞在尾部 PBI区逐渐增多达到高峰，其中在此过程中 lmo2+和c-myb+的双阳性细胞一部分沿着原肾导管迁移至原肾，另一部分沿着尾静脉（caudal vein，CV）向尾部造血组织（CHT）迁移。提示定向造血干细胞的一部分可能由PBI区原始造血干细胞分化而来。此外追踪观察的过程中发现在原肾导管处有 c-myb+的细胞,这群细胞与lmo2+和c-myb+双阳性细胞一起沿着原肾导管向原肾迁移，提示可能一部分定向造血干细胞来源于内皮祖细胞。此外在侧交后的胚胎中追踪观察到，在斑马鱼头部的延髓部位有少量lmo2+和c-myb+双阳性的细胞存在，随后逐渐增多，持续到34hpf，提示斑马鱼头部的延髓可能是定向造血早期一个新的造血位点。
　　结论：①追踪观察斑马鱼原始造血和定向造血的发生和细胞迁移过程，提示斑马鱼定向造血干细胞可能有少部分来源于原始造血干细胞。②在斑马鱼胚胎延髓部位观察到lmo2+和c-myb+双阳性细胞的存在，提示斑马鱼的延髓可能是定向造血一个新的造血位点。

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第一章 利用可示踪转基因斑马鱼研究原始造血和定向造血的关系

摘要

1.前言

2.材料和方法

3. 结果

4 讨论

参考文献

第二章 斑马鱼细胞移植的方法建立

摘要

2.1 前言

2.2材料和方法

3.结果

4.讨论

参考文献

全文小结

英文摘要

致谢

缩略词表

声明

附：综述 斑马鱼造血发育的研究进展