金线莲中甾醇和三萜类化合物提取分析及其抑制人慢性白血病粒细胞K562活性研究

摘要

目的：本论文以CO<,2>超临界流体萃取法提取珍稀药材金线莲中甾醇类和萜类化合物，并对上述两类物质进行定性和定量；初步对中药材金线莲的质量标准进行了研究，为完善中药材金线莲的质量标准提供可参考的数据资料；对金线莲CO<,2>超临界流体萃取产物的抑制人白血病粒细胞K562增殖活性进行研究，并初步探讨其抗肿瘤活性的机理。　　方法：应用CO<,2>超临界流体萃取金线莲中的甾醇和三萜类物质，采用L<,9>(3)M<'3>正交试验设计，以甾醇类及三萜物质萃取率为指标，考察萃取压力、萃取温度及夹带剂对萃取率的影响；并应用HPLC-APCI-MS联用技术，对提取的甾醇物质进行定性和定量分析；三萜类物质应用HPLC-APCI-MS联用技术定性鉴别，采用选择监测离子(selected ion monitoring，SIM)方法进行定量；以齐墩果酸和熊果酸为指标性成分，通过测定了12批药材，对两种物质的最低含量进行规定，按2005年版《中国药典》附录IX H水分测定法第一法、附录IX K灰分测定法、附录XA浸出物测定法对中药材金线莲的水分、总狄分和醇溶性浸出物等进行了测定并规定了限度；以金线莲的CO<,2>超临界流体萃取产物(SFE<,0>)为研究对象，应用MTT法检测SFE<,0>寸人白血病粒细胞K562的细胞毒作用，通过抑制率曲线计算IC<,50>，透射电镜、AO-EB荧光双染色法观察SFE<,0>对K562细胞促凋亡形态学变化，流式细胞仪分析细胞周期改变等。　　结果：CO<,2>超临界流体萃取最佳萃取条件是压力25Mpa、温度55℃，夹带剂EtOH；测得CO<,2>超临界流体萃取产物中麦角甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇含量分别是索氏提取产物中3种甾醇含量的3.95，3.97和4.71倍。用APCI(+)电离源，根据生成(M+H)<'+>准分子离子峰、二级质谱的特征碎片离子峰、保留时间、对照品质谱数据以及文献数据，发现会线莲中含有谷甾醇，豆甾醇，首次确定金线莲中含有麦角甾醇、齐墩果酸和熊果酸；金线莲中麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、齐墩果酸和熊果酸的含量分别为0.968mg/g、1.19 mg/g、1.06 mg/g、0.161 mg/g和0.130 mg/g。12批野生金线莲药材中齐墩果酸和熊果酸的最低含量分别为0.065％和0.059％，水分、总灰分和醇溶性浸出物的范围分别为10.47％～7.32％，11.049％～7.444％和18.127％～10.274％。SFE<,0>显著杀伤体外培养人慢性白血病粒细胞K562，IC<,50>值为11.1μ g/mL，K562经SFE<,0>处理后呈典型凋亡形态学改变，出现亚二倍体细胞峰。　　结论：金线莲中3种甾醇类物质含量较高，均超过1‰，2种三萜类含量相对较低；CO<,2>超临界流体萃取方法具有独特的富积作用和几乎零污染的优势，适合提取金线莲中甾醇类和三萜类物质；野生金线莲药材按干燥品计算，齐墩果酸、熊果酸含量之和不得低于0.124％；SFE<,0>显著杀伤体外培养人慢性白血病粒细胞K562，有效抑制其生长。

目录

论文说明：英文缩写字表

声明

前言

第一部分金线莲中甾醇类物质的分析

一、主要仪器与试药

二、方法与结果

三、讨论

四、结论

第二部分金线莲中三萜类物质的分析

一、主要仪器与试药

二、方法与结果

三、讨论

四、结论

第三部分金线莲质量标准初步研究

一、主要仪器与试药

二、方法与结果

三、讨论

四、结论

第四部分金线莲CO2超临界流体萃取产物抑制K562细胞增殖活性研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第五部分综述 珍稀药材金线莲化学成分的提取与分离

致谢