DPSCs和PRF在犬年轻恒牙牙髓血管再生术中的应用

摘要

目的：本研究通过构建犬年轻恒牙慢性根尖周炎（chronic apical periodontitis，CAP）模型，使用改良的三联抗生素糊剂行根管消毒后刺激根尖出血，添加自体牙髓干细胞和富血小板纤维蛋白，并通过影像学、机械力学、组织学检测探究根管内新生组织的构成，以及通过添加不同的因子，探讨改进该法的可能性。
　　方法：健康6月龄Beagle犬4只，选择双侧上颌第3切牙作为DPSCs（dental pulp stem cells）来源，采用并改良Gronthos等报道的方法进行Beagle犬原代cDPSCs的分离、培养，并进行表型鉴定及GFP（green fluorescent protein）基因的转染。参照Choukroun的方法制备自体PRF（platelet-rich fibrin）。每只犬上颌双侧第2、3前磨牙，下颌双侧第2、3、4前磨牙作为实验牙，成功建立CAP模型后采用改良的三联抗生素糊剂进行根管消毒。实验分为空白对照组和4组实验组，A组：blood clot组，B组：PRF组，C组：cDPSCs组，D组：PRF+cDPSCs组。在刺激根尖出血的基础上添加cDPSCs和PRF，并用MTA（mineral trioxide aggregate）与复合树脂封闭冠部。3个月后，采用平行投照的方法拍摄根尖X线片，观察CAP的愈合情况，并通过Image J软件测量术前术后牙根长度和管壁厚度的变化；使用万能材料试验机测量实验牙的抗折强度，通过与正常牙的对比，评估该法对恢复牙齿抗折强度的效果；通过对实验牙进行HE染色，探明根管内新生组织的组成成分及来源。
　　结果：
　　（1）cDPSCs分离、培养、鉴定结果：Beagle犬牙髓组织分离3 d后可观察到cDPSCs贴壁生长。cDPSCs的增殖曲线符合细胞对数生长曲线。细胞表面标记物 CD146、STRO-1和Vimentin检测均表达阳性。
　　（2）cDPSCs多向分化诱导结果：cDPSCs的成牙本质/骨分化诱导，茜素红染色呈强阳性，可见有大量暗红色矿化结节散在分布。cDPSCs的成脂分化诱导，油红O染色阳性，可见暗红色圆形油脂滴，呈串珠状。
　　（3）GFP基因转染结果：GFP转染48 h后实验组细胞的转染效率已达到80％～90%，但与对照组相比，实验组细胞的生长增殖速率有所减缓，且形态发生一定的改变。
　　（4）改良的TAP（triple antibiotic paste）根管消毒结果：TAP消毒3 W后，38颗实验牙仍有3颗炎症未控制。根管冲洗液进行细菌学培养，在需氧条件下均无菌落形成，而在厌氧环境中，有一个根管来源的培养基出现白色菌落，革兰氏染色呈红色。
　　（5）根尖X线片结果：实验组都出现了根尖暗影愈合，根尖闭合趋势，但差别无统计学意义（P>0.01）。
　　（6）Image J软件测量结果：在牙根增加长度、管壁增加厚度上，4组实验组与对照组间存在显著性差异（P<0.01），实验组均低于对照组，各实验组间的差异无统计学意义（P>0.01）。
　　（7）抗折强度测试结果：4组实验组与对照组间存在显著性差异（P<0.01），4组实验组的折裂力值均低于对照组。B组、C组、D组与A组间的差异无统计学意义（P>0.01）。
　　（8）HE染色结果：实验牙根管内均有血管、类牙骨质、类骨以及类牙周膜等组织生成，但未发现牙本质的形成。4个实验组在根管内新生物的组成和数量上无差别。荧光显微镜下未发现有绿色荧光的组织或细胞。
　　结论：
　　（1）采用并改良 Gronthos等的方法分离、培养 cDPSCs具有很强的自我增殖能力和多向分化能力；
　　（2）改良的TAP首次运用于动物实验中，对感染根管有良好的消毒作用；
　　（3）首次运用慢病毒载体介导GFP基因转染cDPSCs的方法并不适用于牙髓血管再生术中新生组织来源的研究；
　　（4）在传统牙髓血管再生术刺激根尖出血的基础上添加自体PRF和cDPSCs3个月后，证实了根管内的新生物的构成仍主要是类牙骨质、类骨及类牙周膜等组织，未发现有牙本质的形成；牙抗折强度恢复到正常水平的42%～64%。本实验观察到PRF和cDPSCs无明显促进其疗效的作用。

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前言

实验一 犬DPSCs的分离、培养、鉴定和转染

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

实验二 犬年轻恒牙CAP模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

实验三 cDPSCs和PRF对牙髓血管再生术的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

全文总结

参考文献

综述：影响牙髓血管再生术成功的因素

致谢