灵芝孢子油的质量控制及体外抗肿瘤作用的研究

摘要

灵芝孢子油是采用超临界二氧化碳萃取技术（SFE-CO2）从破壁灵芝孢子中提取的脂质活性物质，是灵芝孢子有效成分的集合体，多用于高血脂、乙型肝炎、肿瘤等疾病，灵芝孢子油在全国分布广泛，福建省为灵芝孢子油的主要产区之一。本文主要采用薄层色谱法、高效液相色谱法、气质联用色谱法、气相色谱法对灵芝孢子油的质量进行全面控制，为灵芝孢子油的真伪鉴别和质量控制提供依据，也为灵芝孢子油的进一步开发利用奠定科学基础。主要分为以下五章。 第一章灵芝孢子油的薄层色谱鉴别。方法：采用薄层色谱法（TLC）对灵芝孢子油及普通植物油进行定性鉴别。结果：建立了灵芝孢子油薄层色谱鉴别方法，可有效区分灵芝孢子油和普通植物油。结论：薄层色谱法可用于灵芝孢子油的定性鉴别，特征斑点麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（EG）可用于区分灵芝孢子油与普通植物油，但无法对灵芝孢子油质量优劣进行鉴别。 第二章灵芝孢子油中麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（EG）和麦角甾醇的含量测定。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）和气质联用色谱法（GC-MS）对灵芝孢子油中的EG和麦角甾醇进行含量测定。结果：建立了灵芝孢子油中EG和麦角甾醇的高效液相色谱测定方法，EG在0.71-35.20μg/mL范围内线性关系良好，重复性RSD在0.63%，加样回收率在95.06-98.98%之间（n=6）；麦角甾醇在0.62-62.37μg/mL范围内线性关系良好，重复性RSD在0.21%，加样回收率在94.96-99.12%之间（n=9）。建立了灵芝孢子油中EG和麦角甾醇的气质联用色谱测定方法，EG在0.40-8.04μg/mL范围内线性关系良好，重复性RSD在2.57%，加样回收率在91.32-102.90%之间（n=9）；麦角甾醇在6.35-105.90μg/mL范围内线性关系良好，重复性RSD在2.58%，加样回收率在94.18-105.13%之间（n=9）。结论：高效液相色谱法和气质联用色谱法可准确测定灵芝孢子油中EG和麦角甾醇的含量，可为灵芝孢子油的质量控制提供依据。与气质联用色谱法相比，高效液相色谱法样品更不容易污染色谱柱，操作简便、准确、可靠。 第三章灵芝孢子油中7种脂肪酸的含量测定。方法：采用气相色谱法（GC）对灵芝孢子油及普通植物油中7种脂肪酸（肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸和亚油酸）含量进行测定研究。结果：建立了灵芝孢子油中7种脂肪酸的气相色谱测定方法，经验证各脂肪酸线性关系良好，重复性 RSD均在3.0%以下，加样回收率在96.60-103.33%之间（n=9）。结论：对灵芝孢子油及普通植物油的脂肪酸组成进行有效的比较，结果表明普通植物油的脂肪酸组成与灵芝孢子油相似，不饱和脂肪酸以油酸和亚油酸为主，饱和脂肪酸以棕榈酸和硬脂酸为主，几乎所有批次的灵芝孢子油脂肪酸总量在90%以上，而普通植物油脂肪酸总量约80%，与灵芝孢子油相比含量相对较低。 第四章 ICP-MS分析灵芝孢子油中22种微量元素。方法：采用电感耦合等离子体-质谱法（ICP-MS）对灵芝孢子油样品中的Pb、As、Hg、Cd、Cu、Li、Be、Na、Mg、Al、K、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Se、Sr、Cs、Ba22种元素进行定量分析。结果：建立了ICP-MS法同时测定22种微量元素的分析方法，经验证各元素之间线性关系良好。结论：所测定20批灵芝孢子油样品重金属含量均符合2015版中国药典规定的标准；从检测结果看，灵芝孢子油样品中钠元素的含量最为丰富。 第五章灵芝孢子油的体外药理活性筛选。方法：采用MTT法对灵芝孢子油和灵芝孢子油不皂化物进行体外药理活性筛选。结果：灵芝孢子油可呈剂量依赖性的抑制K562、A549、HepG2及MCF-7细胞的增殖，其IC50分别为12.69μg/mL、20.59μg/mL、34.12μg/mL、37.18μg/mL；灵芝孢子油不皂化物也可呈剂量依赖性的抑制K562、A549、HepG2及MCF-7细胞的增殖，其IC50分别为15.15μg/mL、16.94μg/mL、53.01μg/mL、40.38μg/mL。结论：灵芝孢子油与灵芝孢子油不皂化物均可呈剂量依赖性的抑制人肿瘤细胞的增殖。要达到相同的抑制率，灵芝孢子油不皂化物抗肿瘤作用所需消耗的灵芝孢子油量更大，因此，与灵芝孢子油不皂化物相比，灵芝孢子油具有更强的抗肿瘤活性，可能是去掉的脂肪酸与不皂化物在抗肿瘤作用上具有协同作用。

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前言

第一章 灵芝孢子油的薄层色谱鉴别

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

第二章 灵芝孢子油中EG和麦角甾醇含量测定

第一节 HPLC测定EG和麦角甾醇含量

第二节 GC-MS测定灵芝孢子油中EG及麦角甾醇的含量

第三节 对应批次灵芝孢子粉中EG和麦角甾醇含量测定

第三章 灵芝孢子油中7种脂肪酸的含量测定

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四章 ICP-MS分析灵芝孢子油中22种微量元素

1 材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 小结

第五章 灵芝孢子油的体外药理活性筛选

1 材料

2 实验方法

3 结果及分析

4 小结

第六章 全文小结

参考文献

综述：灵芝孢子油化学成分及药理作用的研究进展

致谢