Bmi1在肝前体细胞增殖分化及肝肿瘤血管生成中的作用

摘要

研究背景及目的：
　　原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的第二大病因[1]。据报道肝细胞癌的全球发病率正在上升，预计到2025年每年新发患者将超过100万人次[1]。手术切除目前仍是肝癌治疗的首选方式，但HCC患者总体的5年生存率低于15%。其主要是因为肝癌所表现出来的肿瘤异质性。
　　血管生成是肿瘤发生和转移所必须的。研究发现，微血管密度与肿瘤生长、转移相关，与多种人类肿瘤的预后有显著相关性；肝癌是一种高度富血供肿瘤，血管生成在肝细胞癌的发生、发展、转移中发挥重要作用。
　　团队前期研究证实肝前体细胞（Hepatic progenitor cells，HPCs）的活化与混合型肝癌术后的复发和生存显著相关，肝肿瘤的癌旁胆管反应(Ductular reaction，DR）的增殖状态（Proliferative index of Ductular reaction，PIDR）与癌旁肝前体细胞的活化具有显著的正相关性[2]，提示癌旁的干性标志物的表达水平（包括Bmi1）可影响到肿瘤的异质性。
　　基因Bmi1参与细胞的增殖与分化，调控细胞凋亡，与多种肿瘤的发生发展密切相关。
　　本研究旨在分析明确：Bmi1的表达和肝前体细胞的活化水平、肝癌患者预后以及肿瘤血管生成水平是否相关；Bmi1的表达与肝前体细胞增殖分化是否相关；癌旁是如何影响到癌的，是否是通过血管生成相关机制发挥作用。
　　研究方法：
　　第一部分回顾性收集了第二军医大学东方肝胆外科医院自1997年10月至2008年5月期间肝切除术后病理诊断为混合型肝细胞-胆管细胞癌的70例患者的临床预后及病理资料。手术病理蜡块均由我院病理科提供。使用抗人CD34、Bmi1、EpCAM、CK7及PNCA抗体通过免疫组化评估患者术后病理切片癌灶的微血管密度(MVD)、癌旁及癌组织的Bmi1和EpCAM表达水平、癌旁CK7-DR及 PIDR的活化水平。使用单因素及多因素分析方法分析 MVD（microvessel density）、Bmi1、EpCAM、K7-DR以及PIDR表达水平对患者预后的影响。最后分析免疫组化标志物之间及各自与MVD的相关性。
　　鉴于第一部分的研究结果，我们进一步于动物体内及细胞水平验证并探究Bmi1对肝前体细胞的活化及分化方向的具体影响，探索Bmi1在癌旁作用于癌促进肿瘤血管生成的机制。
　　采用慢病毒转染技术构建原代肝前体细胞mHPC及肝前体细胞系BNLCL2的 Bmi1过表达细胞株，观察细胞株较未处理组的增殖转移能力的变化以及可能的分化方向。采用CCK-8实验检测细胞株的增殖活性，通过克隆形成实验检测细胞的集落形成能力，经由transwell实验检测细胞的转移侵袭能力。
　　利用Real-time PCR与Western-Blot及细胞免疫荧光技术检测Bmi1过表达肝前体细胞株及其对照细胞株的干性标志物CD133及SOX9，胆系标志物CK7以及纤维化指标α-SMA的表达情况。
　　使用小鼠肝癌细胞的培养上清和缺氧培养条件处理两种过表达 Bmi1的肝前体细胞及其各自对照组细胞，应用Elisa试剂盒检测每组肝前体细胞培养上清中的VEGF水平，并经由Real-time PCR检测肝前体细胞的VEGF mRNA的表达水平明确 Bmi1经由肝前体细胞促进肝肿瘤的血管生成的作用。为在体内水平进一步验，将过表达 Bmi1的肝前体细胞株和小鼠肝癌细胞混合，于裸鼠皮下注射构建皮下荷瘤模型，使用对照肝前体细胞株同样混合处理作为对照模型，3周后拍照取瘤并使用免疫组化评估MVD水平，使用Real-time PCR筛选两组间表达可能有差异的血管生成相关因子，并经由Western-Blot验证。
　　最后使用小鼠肝癌细胞于裸鼠皮下注射构建荷瘤模型，3周后取出皮下瘤块并接种于Bmi1+/-及对照组Bmi1+/+小鼠肝脏构建种植瘤模型，探究癌旁Bmi1对肿瘤相关生物学特性及血管生成的影响。
　　研究结果：
　　1.肿瘤数目＞1及肿瘤直径＞5cm是影响混合型肝癌患者总体生存的危险因素，术中出血＞300ml、TNM分期高、PIDR≥50%、癌旁Bmi1高表达（评分为3+）、MVD＞60/mm2是影响患者术后总体生存的独立危险因素；
　　2.混合型肝癌患者MVD与癌旁Bmi1及PIDR表达水平相关，癌旁Bmi1与PIDR表达水平显著相关；
　　3.Bmi1过表达可提升肝前体细胞的增殖及转移能力；
　　4.Bmi1可促进肝前体细胞的活化，增加胆系标志物 CK7、纤维化指标α-SMA及干性标志物CD133及SOX9的表达；
　　5.Bmi1可促进肝前体细胞血管生成相关细胞因子bFGF、VEGFA、VEGFC的表达。
　　结论：
　　临床数据统计以及免疫组化评估分析发现癌旁Bmi1及HPC的活化与肝癌患者的肿瘤血管生成水平及预后密切相关。
　　通过体内外试验的进一步验证发现 Bmi1与肝前体细胞的生物学特性密切相关；Bmi1可促进肝前体细胞的活化、增加干性及纤维化标志物的表达；并提示癌旁Bmi1可能通过激活HPC分泌血管生成因子促进肝脏肿瘤的发生发展。

目录

声明

附录

第一部分 Bmi1表达及肝前体细胞激活对混合型肝癌患者预后及肝癌血管生成的影响

前言

材料和方法

1. 实验材料

2. 实验方法

结果

1. 患者基本临床特征

2. 混合型肝癌患者癌及癌旁组织中干性及血管生成相关指标表达水平

3. 混合型肝癌患者术后总体生存的危险因素分析

4. 不同癌旁Bmi患者术后总体生存的比较

5. 不同癌旁PIDR患者术后总体生存的比较

6. 肿瘤MVD不同的患者术后总体生存比较

7. 混合型肝癌癌旁及癌组织干性指标与癌旁PIDR的相关分析

7. 混合型肝癌癌旁及癌组织相关指标表达水平与肿瘤MVD的相关性分析

讨论

结论

第二部分 Bmi1与肝前体细胞的增殖分化及肿瘤血管生成的相关性研究

前言

材料和方法

1. 实验材料

2.实验方法

结果

1. Bmi1在原代肝前体细胞及肝前体细胞系中表达水平

2. 体外慢病毒转染Bmi1过表达细胞株的构建

3. 过表达Bmi1对肝前体细胞增殖及转移能力的影响

4. 过表达 Bmi1 对肝前体细胞胆向、干性及纤维化标志物水平表达的影响

5. Bmi1经肝前体细胞促肝肿瘤血管生成的相关研究结果

6. 建立 Bmi1+/-小鼠种植瘤模型验证癌旁 Bmi1 对肿瘤生成的影响

讨论

结论

参考文献

综述:原发性肝细胞癌的血管生成机制及治疗策略的进展

致谢