人结肠癌细胞经5-氟尿嘧啶处理所产生的转录组与表观遗传组的动态应答及获得性耐药机制

摘要

肿瘤细胞及其经药物诱导的获得性耐药细胞株被广泛应用于肿瘤耐药机制的研究。通常，研究者将药物诱导的耐药细胞株与亲本细胞株间的差异表达的基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）作为耐药相关基因。然而，基于此类细胞模型筛选的差异表达基因可能主要反映细胞株对药物处理产生的应答变化，而不一定与耐药机制相关，其相应的研究结果常难以应用于指导临床用药。在前期研究中，我们发现肿瘤细胞及其经药物诱导的获得性耐药细胞分别经药物处理一段时间后，两者之间的差异表达基因可以反映临床患者对药物治疗的响应组与非响应组之间的差异表达模式，因此这些差异表达基因更有可能与耐药机制相关。
　　本研究设计了药物处理实验。选取人结直肠癌细胞株HCT-8/WT及其获得性耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）细胞株（HCT-8/5-Fu）作为研究对象，先将这两种细胞都在不含5-氟尿嘧啶的培养基中培养48小时以消除可能存在的药物残留影响，再分别以5-氟尿嘧啶同时处理0、24、48小时后，检测基因表达谱；5-氟尿嘧啶同时处理0、72小时后，检测DNA甲基化谱。然后，采用本课题组发表的基于可重复性评价的差异表达基因分析算法对基因表达谱与DNA甲基化谱数据进行全面综合分析，筛选得到结直肠癌细胞株 HCT-8/WT及其获得性耐5-氟尿嘧啶细胞株（HCT-8/5-Fu）经药物处理不同时间后的差异表达基因和差异甲基化基因，然后分别评价这些不同时间点的差异表达基因与结直肠癌临床5-氟尿嘧啶治疗响应组-非响应组之间病人的组织差异表达基因（CRG5-Fu）的一致性；综合分析基因表达谱数据和DNA甲基化谱数据，验证二者之间是否存在关联。结果表明，药物处理24小时后，耐药细胞和亲本细胞之间的差异表达基因与CRG5-Fu具有显著的一致性，药物处理48小时后一致性进一步升高，这些基因主要与肿瘤细胞的耐药、增殖、细胞凋亡、细胞周期调控和肿瘤病人的预后密切相关。同时，我们发现基因启动子区域异常高甲基化与该基因的低表达（基因沉默）显著相关，这些基因主要参与嘧啶代谢、药物代谢细胞色素P450信号通路。结果提示：亲本细胞株、耐药细胞株在经过药物处理24~48小时后，两种细胞的基因表达模式的差异与临床样本响应组与非响应组的差异模式吻合，因此对于利用获得性耐药细胞筛选耐药相关基因而言，药物处理24~48小时可获得合理的结果；在亲本细胞向获得性耐药细胞的转化过程中，基因启动子区域高甲基化导致的基因低表达发挥了重要作用。本实验揭示了结肠癌细胞的获得性5-氟尿嘧啶耐药过程中的转录组、表观遗传组的分子改变机制及二者之间的关联，并且证明药物处理时间是筛选耐药相关基因的重要参数，对利用耐药细胞株模型筛选识别结肠癌及其它肿瘤的耐药基因具有广泛的理论与应用价值。

目录

声明

附录一、本文中英文简写对照表

附录二、本文所用程序代码

第一章 前言

1 课题的研究背景及意义

第二章 人结肠癌耐药细胞的培养与药物处理

1 引言

2 细胞培养及药物处理

3 结果

4 讨论

5 本章小结

第三章 亲本及耐药细胞的转录组、表观遗传组的检测

1 引言

2 高通量基因芯片实验

3 结果

4 讨论

5 本章小结

第四章 耐药基因的筛选及相关表观遗传学机制

1 引言

2 耐药相关差异表达、差异DNA甲基化基因及相关耐药机理

3 结果与分析

4 讨论

5 本章小结

第五章 总结与展望

文献综述: 生物信息学在肿瘤药物基因组学研究中的应用

1. 药物基因组学的主要研究内容

2. 生物信息学基本方法

3. 差异基因筛选相关实验

4. 药物基因组学与新药研发

5. 药物基因组学与合理用药

参考文献

攻读博士学位期间所发表的论文

致谢