结缔组织生长因子(CTGF)在BMP9诱导的成骨分化及在肿瘤发生过程中的作用

摘要

本课题的主要研究目的是揭示结缔组织生长因子（CTGF，又称CCN2）在骨形态发生蛋白（BMP）9诱导的成骨分化，以及CTGF在骨肿瘤发生中的作用。
　　 CCN蛋白家族含有6个成员，为CCN1到CCN6，它们均为富含半胱氨酸的分泌性小分量蛋白。CCN蛋白是含有四个功能性结构域的modular蛋白。多数CCN蛋白家族的成员受生长因子、细胞因子或细胞压力的诱导调控。CCN蛋白在成体和胚胎组织的表达模式广泛且差异很大。CCN蛋白可以通过参与并调节多种信号分子而发挥作用，如整合素、BMPs、血管内盘生长因子（VEGF）、Wnts和Notch等。其中，整合素介导的CCN信号传递具有组织和细胞特异性，根据细胞外基质不同而作用各异。
　　 在本课题中，我们首先检测了CCN蛋白家族中最重要的4个成员，CCN1、CCN2、CCN3和CCN4，对BMP9诱导的成骨分化和对骨肉瘤的作用。结果显示CCN2（CTGF）抑制了BMP9诱导的成骨分化，促进了骨肉瘤细胞株143B的增殖和迁移，两个方面均具有显著性差异。于是，我们选择CTGF做进一步深入研究。为了方便表述，本课题大致分为两部分：
　　 第一部分：CTGF在BMP9诱导的成骨分化中的作用
　　 在第一节，我们从孕12.5到13.5天的小鼠胚胎中分离得到了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。进而，我们用携带SV40T基因的逆转录病毒感染MEFs，通过抗生素筛选，得到了永生化的MEFs（iMEFs）。iMEFs细胞株的建立为研究CTGF在BMP9诱导的成骨分化和在骨肉瘤细胞中的作用奠定了基础。
　　 在第二节中，我们评价了4中CCN蛋白，CCN1、CCN2、CCN3和CCN4，对BMP9诱导的成骨分化的影响。处于对数生长期的iMEFs共感染AdBMP9和AdR-CCN1、Ad-CCN2、Ad-CCN3、Ad-CCN4或AdGFP重组腺病毒。在7天后成骨分化早期标志碱性磷酸酶（ALP）用比色发定量测定。结果显示CCN2（CTGF）具有最强的抑制BMP9诱导的骨形成的能力。这一结果促使我们选择CTGF做进一步深入研究。
　　 由于CTGF是一种含有4个结构域的mosaic蛋白，为进一步研究哪个或哪几个结构域发挥着抑制作用，在第三节里我们构建了CTGF的中间缺失和C末端缺失突变体。利用分子生物学技术，我们构建了一系列克隆，最终制作了6种重组腺病毒，它们分别表达CTGF全长、CTGFCD1（无结构域Ⅳ），CTGFCD2（无结构域Ⅲ和Ⅳ），CTGFID1（无结构域Ⅱ），CTGFID2（无结构域Ⅲ）和CTGFID3（无结构域Ⅱ和Ⅲ）。6种腺病毒经蛋白酶K裂解，以基因组DNA为模板做PCR，鉴定了CTGF全长及其突变体的存在。以抗Flag抗体为一抗做Western blon，证实了6种腺病毒可以成功表达CTGF全长及其突变体（CTGF及其突变体均与3×Flag标签融合表达。CTGF全长和缺失突变体重组腺病毒的成功构建，为进一步解析在成骨分化中发挥功能的结构域奠定了基础。
　　 在第四节，我们检测了CTGF全长及其缺失突变体对BMP9诱导的成骨分化的体外影响。用AdBMP9和CTGF腺病毒（AdR-CTGF，CTGFCD1，CTGFCD2，CTGFID1，CTGFID2，CTGFID3）联合感染出于对数生长期的iMEFs细胞，以AdBMP9+AdRFP感染作为对照组。感染7天后检测成骨早期指标ALP的活性（组织染色）。结果显示CTGF全长、CTGFCD1和CTGFCD2能够抑制BMP9诱导的成骨分化，而CTGFID1、CTGFID2和CTGFID3的抑制效果更为显著。
　　 在第五节中，我们检测了CTGF全长及其突变体对BMP9诱导的骨形成的体内作用。感染BMP9+RFP或BMP9+CTGF突变体腺病毒的iMEFs细胞种植于裸鼠皮下。皮下成骨包块在6周后收获。用Micro-CT、HE染色和Masson’s Trichrome染色分析皮下成骨包块的大体和细节信息结果显示，与BMP9+RFP对照组相比，BMP+CTGFCD2和BMP9+CTGFCD1感染得到的包块体积明显增大，而BMP+CTGFID1/2/3组得到的包块体积明显小于对照组。BMP9+CTGF全长组似乎对包块体积无明显影响。组织学分析显示，CTGF缺失突变体通过促进或抑制iMEFs细胞的增殖而影响BMP9诱导的成骨作用。然而，CTGF及其突变体并没有影响BMP9诱导的iMEFs分化。
　　 第二部分：CTGF在肿瘤发生过程中的作用
　　 在本部分的第一节中，我们利用结晶紫染色和划痕试验，研究了CCN1、CCN2、CCN3和CCN4对骨肉瘤细胞株143B和MG63的生长和迁移作用。结果显示CCN1和CCN2可促进143B细胞的增殖和MG63细胞的迁移，而CCN3和CCN4对这些骨肉瘤细胞株的增殖和迁移没有明显的促进作用，甚至有轻微的抑制作用。考虑到我们在第一部分选择了CCN2（CTGF）做深入研究，在第二部分，我们同样选择CCN2（CTGF）做进一步深入研究，即体内实验。
　　 在第二节中，我们利用逆转录病毒感染和抗生素筛选的方法，制作了两种稳定整合和表达荧光素酶基因的骨肉瘤细胞株143B-Luc和MG63-Luc，并用荧光素活性测定实验体外测定了两个细胞株的功能。143B-Luc和MG63-Luc细胞的荧光素酶活性均超过1，000，000，而对照组143B和MG63细胞的荧光素酶活性均低于100。143B-Luc和MG63-Luc细胞株的成功构建为研究CTGF的体内功能奠定了基础。
　　 在第三节，我们检测了CTGF腺病毒直接感染对143B-Luc骨肉瘤细胞体内作用。143B-Luc细胞感染Ad-CTGF或Ad-GFP腺病毒18小时后，注射到裸鼠背部皮下，用Xenogen活体成像技术跟踪肿瘤的生长情况，注射后32天处死裸鼠，收获肿瘤。结果显示，CTGF组的肿瘤包块体积显著大于GFP对照组的包块体积，说明CTGF更够促进骨肉瘤细胞的体内生长。
　　 在第四节，我们利用iMEFs细胞作为CTGF基因的递送载体，检测了CTGF对MG63-Luc细胞的体内作用。iMEFs分别用Ad-CTGF或Ad-GFP感染18小时，感染后的iMEFs细胞与MG63-Luc细胞按照1：1的细胞比例混合，总细胞数为2×106，注射到裸鼠背部皮下。不与iMEFS细胞混合的单独的MG63-Luc细胞作为对照组。用Xenogen活体成像技术跟踪肿瘤的生长情况，注射后25天处死裸鼠，收获肿瘤包块。结果显示，iMEFs+CTGF组的肿瘤包块体积远远大于iMEFs+GFP对照组。iMEFs+GFP对照组与不与iMEFS细胞混合的单独的MG63-Luc细胞作为对照组相比，所得包块体积无明显差别。说明CTGF可促进骨肉瘤细胞的生长，且iMEFs细胞可作为有效的基因递送载体。
　　 总之，我们的研究结果显示，CTGF的结构域Ⅳ可对BMP9诱导的体内成骨有抑制作用，而结构域Ⅰ可促进这种成骨。我们的研究结果还显示CTGF能促进骨肉瘤细胞的体内和体外增殖。另外，表达CTGF的iMEFs细胞显著地促进了骨肉瘤的体内生长，提示CTGF的功能与其所处的细胞外微环境密切相关。
　　 最终，我们的结果将为BMP9和CTGT缺失突变体促进成骨的临床应用，和CTGF作为治疗骨肉瘤靶点的临床应用提供参考。我们的结果也加深了对干细胞分化与增殖理论的认识。