cAMP受体蛋白调控肺炎克雷伯菌kfuABC操纵子的研究

摘要

研究背景：肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)属于革兰氏阴性肠杆菌。近年来成为仅次于大肠杆菌的条件致病菌，主要引起社区获得性和医院内感染，常见的疾病有肝脓肿、肺炎、眼内炎和脑膜炎等。KP的毒力因子主要包括荚膜多糖，脂多糖，铁摄取因子和Ⅰ型菌毛等。铁元素(Fe)是KP生长繁殖所必需的微量元素，铁在KP体内大多以螯合形式存在，KP必须有自己的铁摄取系统来满足菌体生长对铁的需要。kfuABC系统是KP多个铁摄取系统的其中之一，参与菌体对铁的摄取，是KP重要毒力基因。cAMP受体蛋白(cAMP receptorprotein，CRP)是病原菌的重要全局调控子，参与调节菌株的众多分解代谢基因和毒力基因的转录表达。然而在KP中，CRP调控kfuABC基因的转录表达研究还处于开始阶段。
　　研究目的：深入研究cAMP受体蛋白对肺炎克雷伯菌kfuABC操纵子的精细调控机制，为控制肺炎克雷伯菌菌株的毒力奠定基础。
　　研究方法：首先，通过测定生长曲线观察CRP对菌体生长的影响，利用超粘性实验证实CRP对毒力表型的影响。设计相关跨基因引物，利用逆转录PCR鉴定kfuABC操纵子的转录结构。提取肺炎克雷伯菌野生株NTUH-K2044(wild type，WT)的总RNA，采用引物延伸实验研究kfuA的转录起始位点。PCR扩增kfuA的启动子区序列，扩增产物纯化回收，酶切连接入pHRP309质粒无启动子区β-半乳糖苷酶基因的上游，获得重组质粒，分别转入WT和肺炎克雷伯菌株crp基因突变株(△crp)中，通过测定WT和△crp的β-半乳糖苷酶活性来判定CRP调控子对kfuA的调控关系;分别提取WT和△crp的总RNA，将其逆转录成cDNA，通过比较kfuA在WT和△crp中的表达量来进一步验证CRP调控子对kfuABC的调控关系。PCR扩增kfuABC启动子区的DNA序列，表达纯化出有活性的His-CRP蛋白，通过凝胶阻滞实验验证CRP对kfuA启动子区是否有直接的结合，最后采用DNaseⅠ足迹实验确定具体的结合位点。
　　研究结果：生长曲线结果表明肺炎克雷伯菌crp基因敲除后，其生长速度明显慢于野生株和回补株;超黏性实验结果显示△crp的超黏性小于WT。肺炎克雷伯菌kfuA、kfuB和kfuC位于一个操纵子kfuABC上，引物延伸实验发现kfuABC上只有一个转录起始位点，其转录受到CRP调控子的抑制。凝胶阻滞实验和DNaseⅠ足迹实验表明CRP能直接结合到kfuABC启动子区的-204到-171之间的碱基序列上（转录起始位点为+1）。
　　研究结论：crp基因的敲除使得肺炎克雷伯菌的生长速度减慢，KP超黏性的形成能力降低，菌株的毒力减弱。CRP调控子能直接结合到kfuA的启动子区，抑制kfuA基因的转录。本研究首次阐释了肺炎克雷伯菌CRP对kfuABC的精细调控机制，为后续进一步解析肺炎克雷伯菌毒力因子的转录表达调控网络奠定基础。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

1 材料

1．1 菌株及质粒

1．2 酶、试剂盒

1．3 主要试剂和溶液的配制

1．4 主要仪器

1．5 实验所用引物汇总

2 方法

2．1 细菌培养

2．2 生长曲线测定

2．3 超黏性实验

2．4 CRP蛋白的表达与纯化

2．5 逆转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)

2．6 凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assays，EMSA)

2．7 DNaseⅠ足迹实验(DNaseⅠfootprinting assays)

2．8 LacZ报告基因融合实验

2．9 引物延伸实验

2．10 实时定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)

3 结果

3．1 生长曲线测定

3．2 超粘性实验

3．3 CRP蛋白的表达纯化

3．4 kfuABC操纵子结构的鉴定

3．5 引物延伸实验

3．6 His-CRP对kfuA启动子区的结合实验

3．7 CRP对kfuA的调控作用

3．8 kfuA启动子区结构

3．9 CRP对kfuABC基因调控的小结

4 讨论

结论

参考文献

文献综述 肠杆菌科病原细菌cAMP受体蛋白研究进展

致谢

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