利用piggyBac转座系统构建可逆性永生化人牙囊细胞系的研究

摘要

目的：牙囊是包裹在发育牙胚表面的结缔组织，牙囊将发育成为牙周的相关组织和结构。牙囊细胞是存在牙囊中的细胞，其已被证明在体内体外均具有多向分化潜能。但牙囊细胞存在组织来源有限，组织中细胞含量少，细胞在体外增殖困难等特点。因此如何有效的获得足够量的细胞、并保持细胞生物学特性的一致性和稳定性，是组织工程中急待解决的问题。永生化作为获得细胞系的重要手段在组织工程中已广泛应用。但以往的永生化方法存在永生化效率低、有潜在安全隐患等问题。PiggyBac转座系统与传统基因转染方法相比，具有操作简便、效率高、整合位点易确定、转座基因可长期稳定表达等优点。因此，本实验旨在采用piggyBac可逆性永生化系统建立人牙囊细胞系，并对获得的永生化及去永生化牙囊细胞的增殖活性、多向分化潜能进行全面系统的研究。
　　标准的间充质干细胞的多向分化能力通常有限，如何诱导干细胞进行定向分化是研究的热点内容之一，特定的生长因子则是诱导干细胞进行特定方向分化的重要因素之一。骨形态发生蛋白（bonemorphogenetic protein，BMP）和过氧化物酶增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2，PPARγ2）分别是最常用的成骨和成脂诱导分化因子。而目前未见关于BMP9及PPARγ2对牙囊细胞定向分化能力影响的相关研究。因此本实验旨在分析BMP9对原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞的成骨和成软骨能力的影响，以及PPARγ2对原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞成脂能力的影响。
　　方法：
　　1.采用有限稀释法获得单克隆原代牙囊细胞
　　2.采用piggyBac可逆性永生化系统获得永生化及去永生化牙囊细胞
　　3.采用CCK8,细胞计数等方法比较原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞增殖活性。
　　4.采用细胞免疫荧光染色及流式细胞仪检测原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞表面标记物表达。
　　5.采用端粒重复序列扩增程序及石英晶体微天平两种方法检测原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞端粒酶活性。
　　6.采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色、成骨基因及蛋白表达分析原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞体外成骨分化潜能。
　　7.采用阿利新蓝染色、成软骨基因及蛋白表达分析原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞体外成软骨分化潜能。
　　8.采用脂红染色、成脂基因及蛋白表达分析原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞体外成脂分化潜能。
　　9.采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色、阿利新蓝染色、相关基因及蛋白表达分析分析BMP9对原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞体外成骨、成软骨分化能力影响。
　　10.采用脂红染色、成脂基因及蛋白表达分析PPARγ2对原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞体外成脂分化能力影响。
　　11.裸鼠皮下异位植入牙囊细胞后进行HE染色，MASSON染色分析原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞及去永生化牙囊细胞体内分化能力。
　　结果：
　　1.永生化牙囊细胞增殖活性高于原代牙囊细胞，而去永生化牙囊细胞增殖增殖活性与原代牙囊细胞相似。
　　2.原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞均表达牙囊细胞表面标记物。
　　3.原代牙囊细胞端粒酶活性随传代降低，永生化牙囊细胞端粒酶活性增强，且保持在较高水平，不随传代降低，去永生化牙囊细胞端粒酶活性与原代牙囊细胞类似。
　　4.原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性增强、茜素红染色阳性、成骨相关基因及蛋白表达升高。
　　5.原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞成软骨诱导分化后阿利新蓝染色阳性、成软骨相关基因及蛋白表达升高。
　　6.代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞成脂诱导分化后脂红染色阳性、成脂相关基因及蛋白表达升高。
　　7.BMP9感染后，原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞的碱性磷酸酶活性、茜素红染色、成骨成软骨相关基因及蛋白表达均较正常诱导组升高。
　　8.PPARγ2感染后，原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞的脂红染色、成脂相关基因及蛋白表达均较正常诱导组升高。
　　9.原代牙囊细胞、永生化牙囊细胞、去永生化牙囊细胞可在裸鼠背部生成骨样软骨样组织。
　　结论：
　　1.采用piggybac转座系统可以有效的建立永生化牙囊细胞系，所获得的永生化牙囊细胞增殖活性快、多向分化能力强，可广泛应用于组织工程研究中。
　　2.BMP9可有效促进牙囊细胞成骨、成软骨分化.
　　3.PPARγ2可有效促进牙囊细胞成脂分化。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一章piggyBac可逆性永生化牙囊细胞系的建立

1 材料和方法

1.1主要试剂和设备

1.2方法

2 结果

2.1 原代单克隆牙囊细胞的获得

2.2 可逆性永生化牙囊细胞系的建立

2.3 细胞来源鉴定

2.4牙囊细胞增殖活性的检测

2.5牙囊细胞端粒酶活性检测

2.7牙囊细胞致瘤性检测

3 讨论

3.1 piggyBac转座系统建立人永生化牙囊细胞系的转染效率

3.2可逆性永生化牙囊细胞的增殖特性

3.3 可逆性永生化牙囊细胞的端粒酶活性变化

3.4可逆性永生化牙囊细胞的致瘤性

4 参考文献

第二章 永生化牙囊细胞多向分化潜能鉴定

第一节 永生化牙囊细胞体外多向分化潜能鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 牙囊细胞体内多向分化潜能鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述: 牙囊细胞与牙周再生

致谢

攻读博士期间发表文章