棕榈酸增加FAT/CD36表达和棕榈酰化修饰致HepG2细胞内脂质异常积聚

摘要

目的：随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）在世界范围内成为最主要的肝脏疾病之一。脂肪酸转位酶（Fatty acid translocase， FAT/CD36）作为介导长链脂肪酸细胞摄取的膜糖蛋白，在FFA的跨膜转运中起重要作用。本课题旨在观察棕榈酸对HepG2细胞CD36表达和翻译后修饰的作用，并由此造成的对细胞脂质积聚产生的影响。
　　方法：HepG2细胞用不同浓度的棕榈酸处理。用双荧光素酶报告基因检测CD36启动子活性；实时荧光定量PCR（real time polymerase chain reaction,RT-PCR）和免疫印迹（western blot）测定CD36 mRNA和蛋白水平；多聚核糖体分析测定蛋白翻译效率；荧光显微镜实时观测细胞脂肪酸摄入；油红O染色和游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）测定反映胞内脂质含量。将NC-siRNA和CD36-siRNA转入HepG2细胞中CD36的表达，比较CD36下调后对HepG2细胞内脂质积聚的影响。用定点突变的方法将野生型CD36（WT）改建为棕榈酰化修饰位点突变的CD36（AA-SS）真核表达载体，并包装为相应的慢病毒载体，用以感染细胞，并用嘌呤霉素筛选、建立稳定细胞模型。用IP-ABE方法检测细胞CD36棕榈酰化修饰程度；用western-blot和流式细胞技术鉴定CD36在细胞的表达；进一步提取细胞膜脂筏，用western blot方法检测CD36在细胞膜脂筏中的表达情况；用双变量流式及实时摄像的方法动态观察HepG2对荧光标记游离脂肪酸的摄取。
　　结果：棕榈酸只在较高浓度（0.16mM、0.32mM时）增加CD36启动子活性（P<0.05）、mRNA（P<0.05），而在低水平（0.08mM）增加CD36蛋白表达，显著增加CD36蛋白翻译效率。油红O染色发现与对照组相比，棕榈酸组细胞内脂滴增多；酶联免疫吸附实验检测棕榈酸组（240.17±19.83ng/mg）细胞内FFA含量较对照组（144.61±53.52ng/mg）增多（P<0.05）；荧光显微镜发现棕榈酸显著促进了细胞对脂肪酸的摄入。CD36-siRNA组CD36 mRNA与蛋白分别为NC组的0.58±0.08（P＜0.05），0.50±0.10（P＜0.05）。CD36-siRNA组HepG2内脂滴减少，与细胞内FFA定量测定结果相符（ NC组240.17±21.12ng/mg，CD36 siRNA组98.38±14.18ng/mg，P＜0.05），显微镜下动态观察也证实CD36 siRNA组细胞对脂肪酸的摄入速度明显慢于NC组细胞。另一方面，棕榈酸还能显著促进CD36的棕榈酰化修饰。慢病毒感染HepG2细胞中，超表达细胞内CD36的蛋白表达明显高于空载体组，并且棕榈酰化突变组内CD36棕榈酰化修饰程度降低。流式细胞术和western blot发现CD36棕榈酰化突变后对CD36在细胞的总表达无影响，但脂筏中的CD36占总CD36蛋白的比例降低。双变量流式及实时摄像的方法发现CD36棕榈酰化突变后HepG2对荧光标记游离脂肪酸的摄取降低。
　　结论：棕榈酸在转录和翻译水平促进HepG2中CD36表达，并且促进CD36棕榈酰化修饰，从而加重细胞内脂质积聚。棕榈酸在翻译及翻译后水平的调节为我们治疗非酒精性脂肪性肝病提供了线索。

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前言

第一部分 棕榈酸上调FAT/CD36表达致HepG2细胞脂质积聚

第一节：含CD36启动子序列的重组载体的构建

第二节 棕榈酸在HepG2细胞中对CD36基因表达及脂质积聚的影响

第三节抑制CD36表达对HepG2细胞CD36表达及细胞内脂质积聚的影响

讨论

第二部分 CD36棕榈酰化位点突变后对HepG2细胞CD36功能的影响

第一节 棕榈酸促进HepG2细胞中CD36的棕榈酰化修饰

第二节 利用定点突变的方法获得棕榈酰化位点突变的CD36质粒

第三节 稳定超表达CD36的HepG2细胞系的建立及鉴定

第四节CD36棕榈酰化位点突变后对HepG2细胞CD36功能的影响

讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 非酒精性脂肪性肝病发病机制研究

致谢

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