大麻素对HPV感染引起的宫颈癌的作用机制及HBV慢性感染的小鼠模型的建立

摘要

研究背景与目的:
　　病毒（virus)由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质（Protein）构成或仅由蛋白质构成。一般按遗传物质的不同可将病毒分为DNA病毒、RNA病毒和蛋白质病毒，其中 DNA病毒只能感染一种动物（个别例外）。现代医学发现病毒不但具有致病性，一些病毒也具有致癌性。目前的实验研究证明宫颈癌的发生与 HPV感染有关，肝癌的发生与HBV感染有关。宫颈癌已成为仅次于乳腺癌的常见妇女恶性肿瘤疾病。根据现有的的数据统计，全球范围内的宫颈癌患者中每年的死亡人数将近20万。每年有高达51万的新发病例而中国每年的新发病例就超过10万。与此同时，中国现有乙肝病毒携带者超过1亿，其中每年因罹患肝癌死亡的人数约有30万。在慢性肝炎患者中，一部分患者肝脏会发生肝纤维化，并进一步发展为肝硬化、肝癌。
　　大麻素是从印度大麻（Cannabis indica）里发现的一组萜酚类化合物，存在于动物神经系统和免疫系统。大麻素发生生物效应的基础是大麻素受体。研究发现，大麻素对乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤等具有抑制作用，在肿瘤组织中，增加大麻素受体在组织中的分泌可以选择性抑制细胞的恶性增殖。另一些研究发现大麻素能够影响HBV慢性感染的患者的肝组织病变进程。
　　本研究旨在构建 CB1/CB2基因真核表达载体，选取人肾胚细胞（HEK293）作为生物载体，研究大麻素的生物学特性；选取宫颈癌CaSki细胞系作为研究对象，研究大麻素对对宫颈癌凋亡的影响及相关机制；利用 HBVcccDNA建立慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型，研究大麻素对肝炎肝组织病变进程的影响及机制。为阐明CB基因的生物活性及其对宫颈癌的影响和机制提供实验依据，同时为进一步研究CB基因对HBV引起的肝损伤可能的作用提供了动物模型。
　　方法:
　　1.通过PCR扩增获取目的基因（cannabinoid receptor gene, CB基因）。
　　2.通过双酶切，载体连接，感受态转化，质粒提取等方法获得CB基因真核表达载体，并通过双酶切鉴定重组质粒。
　　3.利用脂质体转染法将 CB基因真核表达载体转入 HEK293细胞中，通过细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测CB基因的表达及细胞定位。
　　4.利用脂质体转染法将CB基因真核表达载体转入CaSki细胞中通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
　　5.通过Western blot和实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax、Bad相关凋亡因子的表达，研究CB基因对宫颈癌的作用机制。
　　6.通过PCR扩增获得HBV基因，经酶切、纯化后环化等生物方法制备HBVcccDNA。
　　7.利用水动力法尾静脉注射HBVcccDNA至C57BL/6小鼠体内。注射后，分别于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w经小鼠尾静脉采集血清样本；于第1w、3w、6w、10w经颈椎脱臼处死后取肝组织。
　　8.利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒 e抗原（HBeAg）的浓度变化；荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数；免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和HBcAg的表达；苏木素-伊红（HE）染色观察肝组织病理变化。
　　结果:
　　1. PCR产物电泳后分别得到rCB1（1.5Kb）、CB1（1.5Kb）、CB2（1.1Kb）片段。
　　2.双酶切重组质粒后电泳， pCDNA3.1(+)-CB1质粒出现5.3 Kb和1.5 Kb两条带，GV230- CB1质粒出现5.3 Kb和1.5 Kb两条条带， GV230-CB2质粒出现5.3 Kb和1.1Kb两条带。
　　3.重组质粒转染HEK293细胞后，细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦发现CB蛋白表达于HEK293细胞膜和细胞质。
　　4.重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞，流式细胞检测发现CB转染组的细胞凋亡率大于空白组的细胞凋亡率。
　　5.WB和qRT-PCR检测Bcl-2、bad、bax凋亡因子发现CB转染组的bad、bax表达上调，而Bcl-2呈下调。
　　6.PCR获得3.2KbHBV片段， BspQⅠ酶切、纯化、T4DNA连接酶连接后获得环化的HBVcccDNA
　　7.放射免疫法检测不同时间点的血清样本，发现 HBsAg、HBeAg在小鼠血清中均有表达均呈现四个上升-下降曲线；荧光定量PCR结果显示，随着时间的推移，HBV DNA拷贝数呈下降趋势；免疫组化法检测发现HBsAg、HBcAg在肝组织中表达；HE染色病理分析发小鼠肝脏出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化。
　　结论:
　　1.成功构建了CB基因真核表达载体，并证明CB在细胞质和细胞膜上的表达。
　　2.CB能够促进宫颈癌细胞的凋亡。
　　3.CB能够促进宫颈癌细胞凋亡的机制是通过抑制Bcl-2，上调bad、bax。
　　4.成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型。

目录

封面

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 CB1/CB2基因真核表达载体的构建

1材料

2方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二部分：CB1/CB2对宫颈癌CaSki细胞凋亡的影响及作用机制

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三部分 HBV慢性感染的小鼠模型的建立

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4讨论

参考文献

全文总结

文献综述:大麻素在肿瘤与肝病领域中的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文