大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的突变型佐剂活性及其作用机制研究

摘要

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基（LTB）是一种很好的粘膜免疫佐剂，已有研究发现，LTB可以与细胞表面神经节苷脂（GM1）结合[1]，进而发挥佐剂效应，除此之外，其他相关信号通路作用机制仍未有明确的报道，一直是推动进一步研究的瓶颈，因此，到目前为止粘膜免疫佐剂仍未被应运到临床中。本研究在野生型LTB的基础上设计了4种T细胞和B细胞表位突变型，研究比较找出具有佐剂活性的突变型，进而为LTB详细作用机制的进一步研究提供依据。
　　目的:
　　野生型LTB及其突变型的佐剂活性比较研究，初步评价LTB突变对其粘膜免疫佐剂活性的影响，找出佐剂增效相对较强的突变型，分析野生型LTB及其突变型的作用机制。
　　方法：
　　本研究利用高保真DNA聚合酶通过PCR的方法对LTB进行定位突变，构建重组质粒 pET32a-LTB26、pET32a-LTB34、pET32a-LTB57和pET32a-LTB85，通过菌液PCR检测、质粒酶切检测以及测序验证，鉴定突变型的正确性，确定突变型蛋白表达的最适条件，诱导表达蛋白，通过SDS-PAGE检测野生型LTB及4种突变型蛋白大小，采用His标签纯化蛋白，TGE透析复性，PEG8000对蛋白进行浓缩，得到高纯度的LTB、LTB26、LTB34、LTB57和LTB85蛋白，去除蛋白内毒素，分别联合VP8免疫Balb/c雌性小鼠（免疫期间小鼠生命体征正常），收集小鼠的血清和肺洗液，采用间接ELISA法检测血清和肺洗液中的 IgG和 sIgA水平。以Anti-NLRP3、Anti-AKT1、Anti-MAP2K3和Anti-MAP2K4为一抗，通过免疫组化法检测免疫小鼠鼻粘膜组织和脾脏组织中NLRP3、AKT1、MAP2K3和MAP2K4受体的表达量。
　　结果：
　　1.成功构建pET32a-LTB26、pET32a-LTB34、pET32a-LTB57和pET32a-LTB85突变型重组质粒。
　　2.在E.coli BL21（DE3）中表达了带His标签的LTB26、LTB34、LTB57和 LTB85融合蛋白。ELISA实验结果证明突变型 LTB26和LTB34联合VP8免疫小鼠的血清和肺洗液中的特异性IgG和sIgA抗体水平明显高于LTB联合VP8组，初步筛选出了两种佐剂活性进一步提高的突变型LTB26和LTB34。
　　3.免疫组化结果显示：NLRP3在鼻粘膜 LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐剂组中的表达量均低于VP8对照组，相似地，NLRP3在脾脏组织LTB+VP8和LTB26+VP8佐剂组中的表达也表现出了类似的趋势；AKT1在鼻粘膜LTB26+VP8佐剂组中表达高于VP8对照组，其余各组均低于VP8组，而AKT1在脾脏组织LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐剂组中的表达均明显高于VP8组（P＜0.05）；MAP2K3在鼻粘膜LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐剂组中的表达均低于VP8组和LTB57+VP8组（无统计学差异），而MAP2K3在脾脏组织LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐剂组中的表达量均高于VP8和 LTB57+VP8对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MAP2K4在鼻粘膜LTB+VP8和LTB26+VP8组的表达均稍高于VP8组，而MAP2K4在脾脏组织LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐剂组中的均明显高于VP8组和LTB57+VP8组。
　　结论：
　　1.成功表达了带His标签的LTB26、LTB34、LTB57和LTB85融合蛋白；
　　2.筛选出了佐剂活性进一步增强的突变型 LTB26和LTB34；
　　3.初步推测NLRP3与LTB及LTB26的佐剂增效机制无关；AKT1可能与LTB26突变型的佐剂增效机制呈正相关；MAP2K4与LTB和LTB26佐剂活性呈正相关性；MAP2K3在脾脏组织中与LTB及其突变体的佐剂活性呈负相关性，而在粘膜组织中与LTB及其突变体的佐剂活性呈正相关性，这种在不同免疫组织中的异质性以及不同突变体在同一免疫组织中的差异性为进一步了解LTB及其突变体的佐剂机制研究奠定基础。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 基因突变的设计与克隆

1 实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二部分 蛋白表达、纯化及鉴定

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第三部分 突变型的免疫佐剂活性及作用机制初步研究

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

参考文献

文献综述:粘膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间的论文