GSK3β通过调控53BP1诱导神经胶质瘤细胞DNA损伤修复的机制研究

摘要

背景及目的： 神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45％。胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，属于胶质瘤WHO分级系统中IV级高级别胶质瘤。临床GBM治疗方案为手术为主联合放化疗，但手术无法完全切除呈浸润性生长的肿瘤。放疗产生的DNA双链断裂（DNA double strand breaks，DSBs）是导致肿瘤细胞凋亡在主要原因，但由于肿瘤细胞对DSBs能进行损伤修复，使得断裂的DNA得以修复，从而治疗效果欠佳。因此 GBM患者的特征是放疗抵抗（radioresistance）、复发率高与平均存活率低。综上所述，本研究的主要目的是深入研究胶质瘤放疗抵抗的分子机理。以往的研究表明GSK3β主要参与肝糖原合成酶磷酸化失活的血糖调节途径，但本研究发现 GSK3β作为重要的 DNA损伤调控因子，参与了GBM细胞电离辐射（ionizing radiation，IR）后的DNA损伤修复。但胞浆蛋白GSK3β是如何参与细胞核内DNA损伤修复以及通过何种信号途径来参与DNA损伤修复，目前尚不明确。 53BP1是针对产生的DNA双链断裂损伤做出反应的重要调控因子，在胶质瘤细胞中 DSBs信号传递、细胞检验点激活以及 DSBs修复过程中具有多种作用。此前针对53BP1参与DSBs修复的研究，主要集中在其作为p53蛋白与ATM下游分子的作用，53BP1蛋白尚有多个磷酸化激活位点与结构域功能有待进一步研究探讨。此外DSBs修复，是一个多种信号传导机制与蛋白作用的过程，因此进一步阐明53BP1在促进DSBs修复作用、抑制肿瘤细胞凋亡中的具体机制，对于提高神经胶质瘤放疗的敏感性具有重要作用。这提示我们，GSK3β在胶质瘤放疗时，可能完成胞浆到胞核的转移，并参与到53BP1介导的DSBs修复过程，导致放疗抵抗的出现，但其具体分子机制尚待进一步明确。明确 GSK3β调控53BP1参与其介导的DNA损伤修复的具体分子机制，可以为开发以GSK3β为靶点的放疗增敏剂提供理论基础和实验依据。 方法： 1、使用自屏蔽137Cs照射器以5 Gy IR总剂量照射U87细胞，通过免疫荧光染色的方法检测GSK3β是否进入细胞核。 2、通过免疫共沉淀法，检测GSK3β是否与53BP1结合。采用免疫荧光染色法、DNA损伤检测试剂盒与MTT实验来观察检测，GSK3β抑制（化学抑制剂SB216763）或GSK3β基因沉默（siRNA）条件下，U87细胞在电离辐射后的DNA损伤修复情况。初步探究GSK3β参与DSBs修复的分子机制。 3、通过体内磷酸化实验，检测GSK3β对53BP1的磷酸化作用，同时观察加入GSK3β抑制剂（SB216763）或者将GSK3β基因沉默后以及加入磷酸化酶抑制剂λ-PPase观察53BP1在细胞内被磷酸化的程度。此外，构建带有表达标签的Flag-GSK3β-pBABE-puro重组质粒、GST-53BP1-pcDNA3质粒，转化293T细胞表达重组蛋白，纯化蛋白后进行体外磷酸化实验。通过体内、体外磷酸化实验，探讨53BP1是否被GSK3β磷酸化。 4、基于体内体外磷酸化结果，初步得出GSK3β磷酸化53BP1这一结论后，进一步探讨53BP1被GSK3β磷酸化的位点。首先通过分子克隆的方法构建含有53BP1各片段的质粒（1-361，302-718，667-1052，986-1353，1052-1709，1703-1972），并经过表达纯化后进行体内、体外磷酸化实验确定53BP1磷酸化片段；确定53BP1被GSK3β磷酸化的片段以后，通过Quick Change定点诱变试剂盒进行用Ala（A）取代Ser（S），对53BP1第166位、176位丝氨酸进行定点突变。观察GSK3β对野生型和突变型53BP1（S166A、S176A）磷酸化作用的差异；通过免疫荧光染色、DNA损伤检测与MTT实验这三种研究方法，进一步从阐述GSK3β磷酸化53BP1参与DSBs修复的具体机制。 5、构建荷瘤鼠模型，设置对照组、IR组、SB216763组与SB216763+IR组；记录荷瘤鼠的皮下移植肿瘤的体积、直径与重量，用TUNEL原位染色观察细胞原位凋亡；记录荷瘤鼠的体重以及100天生存率。从体内、体外水平，评价GSK3β磷酸化53BP1在DNA损伤修复中的重要性，为GSK3β抑制剂研发成为放疗增敏剂提供科学依据。 结果： 1、电离辐射后，GSK3β从胞浆转移到胞核；GSK3β进入细胞核以后与53BP1结合，参与促进γ-H2AX、Mre11、NBs1等DNA损伤修复因子的聚集；GSK3β抑制后能显著提高U87细胞对电离辐射诱导DSBs的敏感性与细胞增殖率、降低DNA损伤百分比。GSK3β被抑制和基因沉默后，能抑制DNA损伤修复诱导细胞凋亡。 2、电离辐射后，GSK3β从胞浆转移到胞核，与53BP1结合并磷酸化53BP1。体外带有表达标签的 Flag-GSK3β与 GST-53BP1磷酸化实验结果表明，GSK3β与53BP1结合，并且磷酸化53BP1。将GSK3β活性抑制后，则53BP1被磷酸化程度明显降低。 3、通过构建不同片段的53BP1，进行体内体外磷酸化实验，结果表明GSK3β磷酸化53BP1的片段位于 N1（1-361）段。进一步通过点突变的方法，观察到53BP1被GSK3β磷酸化的位点是166位丝氨酸（Ser）。通过损伤修复下游信号通路蛋白γ-H2AX、Mre11、NBs1的免疫荧光染色、DNA损伤检测以及细胞增殖检测，观察到166位Ser突变的53BP1，抑制DNA损伤修复，进一步揭示GSK3β磷酸化53BP1的166位Ser，从而促进DNA损伤修复。 4、通过体内荷瘤鼠实验，观察到与对照组以及单独使用IR或GSK3β抑制剂（SB216763）相比，SB216763+IR组荷瘤鼠的肿瘤的体积变小、直径变短、重量减轻，并且 TUNEL染色可见明显的 DNA断裂凋亡。除此以外， SB216763+IR组小鼠体重逐步增加，存活率明显升高。 结论： 在胶质母细胞瘤中，电离辐射诱导 DSBs，GSK3β能从胞浆转移到胞核与53BP1结合，并磷酸化53BP1的166位Ser，促进DNA损伤修复。而GSK3β抑制剂能显著提升U87细胞对放疗的敏感性，因此GSK3β可作为GBM放疗增敏的关键靶点。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 GSK3β参与GBM细胞中53BP1介导的DSBs损伤修复

前言

第一节 放疗诱导GSK3β进行核内迁移的研究

第二节 GSK3β参与53BP1介导的DSBs修复的方式与功能学效应研究

讨论

结论

第二部分 GSK3β作用于53BP1的位点及其与DSBs修复的分子机制研究

前言

第一节 GSK3β磷酸化53BP1参与DSBs修复

第二节 53BP1被GSK3β磷酸化片段筛选

第三节 明确GSK3β磷酸化53BP1 的氨基酸位点

第四节 GSK3β磷酸化53BP1 的氨基酸位点参与DSBs修复功能学研究

讨论

结论

第三部分 荷瘤鼠分析GSK3β磷酸化53BP1参与DSBs修复研究的体内功能评价

前言

第一节 GSK3β 抑制剂联合 IR 对荷瘤鼠体内移植瘤的抑制作用

第二节 GSK3β 抑制剂联合 IR 对荷瘤鼠体重与荷瘤鼠生存曲线分析

讨论

结论

全文总结

本课题的创新性及意义

参考文献

文献综述:53BP1参与基因修复过程的研究进展

致谢

博士期间发表的论文