中华眼镜蛇(Naja atra)蛇毒中的两种重要成分(氨肽酶和磷脂酶A2)的分离纯化及其性质研究

摘要

毒蛇咬伤（俗称蛇伤）被WHO规定为一种被忽视的热带疾病，其多发于热带或亚热带的贫困山村。蛇伤中毒常常给蛇伤患者带来身体损害、经济负担和心理恐慌后遗症等。蛇伤急救之首要前提是搞清蛇毒的组成成分及其致毒病理分子机制。研究表明，总体上看，蛇毒是一种复杂的混合物，含有多种酶、蛋白质、活性小肽及无机物等，因毒蛇种类不同其毒素成分有差异，依据毒性可以分为神经毒蛇毒、血循毒蛇毒以及混合毒蛇毒，其主要作用于蛇伤患者的神经、血液和肌肉系统，给他们带来在心血管系统、神经系统或肌肉系统等方面的损伤或紊乱。因此搞清蛇毒的组成成分及其功能对于蛇伤的急救是非常重要的。 中华眼镜蛇（Naja atra）是我国引发蛇伤高发的毒蛇种类之一，其毒液主要为神经毒与血液毒的混合类型，尽管对该蛇毒的研究报道较多，但对该蛇毒的全貌成分的构成仍然缺乏系统研究，尤其是氨肽酶成分研究缺乏。当前，还未有从中华眼镜蛇毒中鉴定出氨肽酶的报道，为此，本研究首次主要针对该蛇毒中的氨肽酶成分进行分离鉴定，拟鉴定出该酶；同时，由于蛇毒中存在多种类型的磷脂酶A2（PLA2）亚型，故对该蛇毒中的PLA2进行分离纯化与鉴定研究也有一定的意义。这些研究为弄清该毒蛇引发蛇伤致毒致病的分子机制奠定基础。 我们通过系列实验后，现将获取的结果，归纳整理如下： 一，通过咬皿法采取新鲜毒液，经低温冻干后，将中华眼镜蛇毒进行HiTrap-Sepharos Fast Flow 阳离子交换层析后，再将有氨肽酶活性的峰进行Amastatin-AH Sepharose 4B亲和层析，最终得到有氨肽酶活性的组分，该组分通过还原性SDS-PAGE分析鉴定，其呈现单一条带，其分子量约为150 kD，利用BCA蛋白法，测得纯化后最终所得目的蛋白浓度1.4 mg/ml。 二，通过该氨肽酶组分的活性与性质实验表明：在研究pH值对氨肽酶活性的影响实验表明，该氨肽酶在反应体系的pH为8.5时，分解底物时活性最强；；温度影响实验表明，该氨肽酶发生水解谷氨酸对硝基酰苯胺酸（Glu-pNA）的最适温度为35℃金属离子影响实验表明，有的金属离子（如Ba2+、Ca2+、Sr2+等）可明显增加氨肽酶水解Glu-pNA的活性，有金属离子（如Ni2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+以及Cd2+）则明显抑制氨肽酶水解Glu-pNA的活性，且当它们的离子浓度达到1 mM时，可完全抑制该氨肽酶水解 Glu-pNA的活性；选用五种人工合成的底物 Asp-pNA、Leu-pNA、Glu-pNA、Arg-pNA 和Ala-pNA进行该氨肽酶组分的水解活性测试，结果表明，这五种底物中，Glu-pNA是最适的底物；通过中华眼睛蛇毒免疫鸡，从鸡蛋中获得抗蛇毒IgY抗体与该氨肽酶反应，实验表明，该氨肽酶组分与该IgY无明显中和效应，该结果提示该氨肽酶组分在中华眼镜蛇毒中的含量非常低，无法在该蛇毒免疫鸡时导致抗该氨肽酶组分的抗体产生。 三，通过两步法，即Hi Trap-Sepharos Fast Flow阳离子交换层析和HPLC层析，从中华眼镜蛇毒中分离得到具有PLA2活性的组分，该组分通过SDS-PAGE鉴定为单一条带，其分子量大约为 17 kD; 该组分经HPLC分析呈单一峰。这些结果提示我们分离纯化得到的具有PLA2活性的组分为单一组分。 四，采用磷脂酶活性检测法，测试该组分的酶活性以及温度、pH、金属离子对该酶活性的影响，实验表明，随pH升高，该酶水解鸡卵黄底物活性增强，且当pH为10左右时，水解活性最强；该酶水解鸡卵黄底物的最适温度为37℃。K+、Na+、Ca2+能增加PLA2的酶活性，而Zn2+、Fe2+能则抑制该酶的活性。 五，我们通过用中华眼镜蛇毒免疫鸡，从鸡蛋中获得抗蛇毒的Ig Y抗体。把从该蛇毒中分离纯化PLA2组分分别与该Ig Y抗体进行中和能力实验，实验表明，PLA2组分与该Ig Y抗体有中和效应出现，并呈现量效关系，其ED50为4.568μg。结果提示，该蛇毒的PLA2组分含量较高，能在免疫鸡时产生抗PLA2组分的抗体。 总之，本研究从中华眼镜蛇毒中获得两个重要组分氨肽酶和PLA2，并初步分析测试了它们的酶活力和部分性质，同时也初步评估了在该蛇毒免疫鸡时所产生的抗蛇毒Ig Y对这两个组分的中和能力，这些结果为制备抗蛇毒抗体和为进一步弄清该蛇毒致伤的分子机制提供了基础。但该两个组分的氨基酸序列和结构有待下一步研究。

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摘 要

ABSTRACT

1 引言

1.1 研究背景、目的与意义

1.2 本研究的主要内容

1.2.1中华眼镜蛇粗毒的制备

1.2.2 中华眼镜蛇粗毒的生物活性检测

1.2.3 蛇毒中氨肽酶的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究

1.2.4 蛇毒中PLA2的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究

1.3 本研究技术路线

2中华眼镜蛇粗毒的制备及其活性的测定

2.1材料与方法

2.1.1主要仪器与设备

2.1.3 试剂的配制

2.1.4 中华眼镜蛇粗毒的制备

2.1.5 中华眼镜蛇粗毒活性的检测

2.2 结果

2.2.1中华眼镜蛇蛇毒中蛋白含量

2.2.2 中华眼镜蛇蛇毒LD50的测定

2.2.3氨肽酶和PLA2活性检测

2.3 讨论

3 中华眼镜蛇毒中氨肽酶的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究

3.1材料与方法

3.1.1主要仪器与设备

3.1.2 主要材料与试剂

3.1.3 主要试剂的配制

3.1.4步骤与方法

3.2 结果

3.2.1 氨肽酶的分离纯化

3.2.2 蛇毒中氨肽酶分离纯化效果及分子量的测定

3.2.3 蛇毒中氨肽酶浓度的的测定

3.2.4 蛇毒中氨肽酶理化性质的的测定

3.2.4.5 IgY对氨肽酶的中和作用

将一定剂量的IgY与分离纯化所得到的较高纯度的氨肽酶的中和实验中，其结果显示，抗中华眼镜蛇IgY不能

3.3 讨论

4 蛇毒中磷脂酶A2(PLA2)的分离纯化、鉴定、活性及其性质研究

4.1 材料与方法

4.1.1 主要仪器与设备

4.1.2 主要材料与试剂

4.1.3 主要试剂的配制

4.1.4方法与步骤

4.2结果

4.2.1 PLA2的分离纯化

4.2.2 蛇毒中PLA2分离纯化效果及目标组分纯度检测

4.2.3 PLA2活性的测定

4.2.4 PLA2理化性质的测定

4.2.4.4 IgY对PLA2的中和作用

4.3 讨论

蛇毒是一种成分复杂的化合物，主要成分包括各种酶、蛋白质或肽，占蛇毒干重的90%以上。当前，对蛇毒中单

在中华眼镜蛇毒磷脂酶的分离纯化中，我们采取了HiTrap-Sepharos Fast Flow阳离子

本研究中分离得到的PLA2, 在分离纯化方法以及分子量大小上与之前已有的报道有所差异。PLA2在蛇伤

5 全文小结

6 文献综述

参考文献

附录A 作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况

致谢