果实采后病害拮抗菌的分离筛选及其抑菌效果的研究

摘要

柑橘青霉病和梨黑斑病是柑橘、梨果实贮藏期的主要侵染性病害，是造成腐烂损失的重要原因。长期以来，使用化学杀菌剂一直被认为是防治果实采后病害最有效的方法，但是存在着农药残留、环境污染和病原菌抗药性等诸多弊端，迫切需要新的安全的保鲜方法来取代化学杀菌剂的使用。生物防治是选择对产品以及人体不造成危害的微生物，利用微生物之间的拮抗作用，抑制病原菌生长的一种有效防治采后病害的新途径。 本研究旨在分离、筛选能够抑制果实采后青霉、链格孢霉的拮抗菌株，鉴定其生物学特性，并测定所筛选出的菌株YF1，YF4和BF2及不同混配处理对柑橘青霉病和梨黑斑病的抑制效果，以及在果实伤口的定殖情况，并对其保鲜机理进行初步探讨。主要结果如下： 1.拮抗菌的分离和筛选：用稀释平板法，从果实伤口、果实表面、叶片以及果园根际土壤中分离得到102个菌株。应用平板对峙法，通过初筛和复筛，离体筛选出10个菌株对青霉菌(Penicillium italicum)有拮抗作用，9个菌株对链格孢霉 (Alternaria kilcuchiana)有拮抗作用。进一步通过果实接种法，活体筛选出分别能明显抑制青霉和链格孢霉的拮抗菌YF1，YF2和：BF2，室温(约25℃)下抑菌率分别为79.12％，62.5％和66.67％。 2.拮抗菌的鉴定：根据酵母菌的形态特征、营养特征和生理特性，鉴定拮抗菌YFl为假丝酵母属(Candida sp)，YF4为柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apieulata)。在对拮抗菌BF2的鉴定中，首先采用细菌传统的鉴定方法，对菌体的表型、生理生化特征进行了分类鉴定，结果发现，BF2符合芽孢杆菌属细菌的特征。进而采用16S rDNA分子鉴定方法，通过同源性比对及系统发育分析，鉴定拮抗菌BF2为芽孢杆菌属的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。 3.拮抗菌的抑菌试验：当拮抗菌浓度为10<'6>-10<'8>CFU/mL时，生物防治的效果与拮抗菌的浓度成正相关；分别在接种1×10<'8> CFU/mL拮抗菌YF1、YF4和BF2的前48 h，24 h，2 h，0 h、后2 h，24 h，48 h接种病菌，同时和推后病菌接种时间，都可以维持抑菌效果，但是提前接种病菌拮抗菌的抑菌力会有所降低。拮抗菌的接种时间越早防治病害的效果越明显；YF1与YF4等体积混合用于防治青霉病，果实发病率为12.50％，优于YF1和YF4单独使用的效果，差异显著;YF1，YF4和BF2两两混合使用抑制梨黑斑病，均可显著抑制梨黑斑病的发生，发病率分别为17.5％，10.00％和15.83％，低于单独使用一种拮抗菌；CaCl<,2>和低剂量化学杀菌剂能够明显增强拮抗菌的抑菌效果，水杨酸与拮抗菌结合使用与单独使用拮抗菌相比，对柑橘青霉病和梨黑斑病发病率的影响不大。4.拮抗菌的生长动态：拮抗酵母菌YF1和YF4在有无青霉菌和链格孢霉菌作用的情况下都能够在果实伤口迅速生长定殖。菌株YF1接种48 h后，数量增加123.26倍；同时接种青霉病菌，96 h后YF1的数量可增加至144.17倍，与链格孢霉同时接种，96 h后YF1数量增加至178.29倍；拮抗菌YF4接种72 h后，数量增加了近200倍，同时接种青霉病菌，72 h后繁殖数量是起始值的344.54倍，同时接种链格孢霉，72 h后繁殖数量是起始值的294.12倍。 5.用1×10<'8> CFU/mL的酵母菌YF1和YF4浸泡柑橘果实后，柑橘果皮的PAL(苯丙氨酸解氨酶)、POD(过氧化物酶)显著升高，PPO(多酚氧化酶)显著降低；在柑橘果实的伤口处添加青霉(Penicillium italicum)的孢子悬浮液可以显著诱导柑橘产生β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性。说明两种酵母菌都能诱导柑橘果实产生抗病性。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1采后病害生物防治的意义

1.2拮抗菌防治果蔬采后病害的研究进展和应用现状

1.3拮抗酵母菌的作用机理

1.3.1产生抗生素

1.3.2营养与空间的竞争

1.3.3寄生作用

1.3.4诱导寄主抗性

1.3.5其它物质对拮抗菌的强化作用

1.4拮抗菌的应用前景及存在的问题

1.4.1发展前景

1.4.2存在问题

1.5研究目的

1.6研究方法和技术路线

1.6.1研究方法

1.6.2技术路线

2拮抗菌的分离与纯化

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.4讨论

3拮抗菌的筛选

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.2.3统计分析

3.3结果与分析

3.3.1离体筛选

3.3.2活体筛选

3.4讨论

4拮抗菌的分类鉴定

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1菌种

4.2.2试剂

4.2.3实验方法

4.3结果与分析

4.3.1酵母拮抗菌的鉴定结果

4.3.2拮抗细菌的鉴定结果

4.4讨论

5拮抗菌对果实采后病害的抑制效果及对果实生理特性的影响

5.1引言

5.2材料和方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.2.3统计分析

5.3结果与分析

5.3.1不同浓度拮抗菌对青霉、链格孢霉的抑制效果

5.3.2拮抗菌不同接种时间对柑橘青霉病、梨黑斑病的抑制效果

5.3.3混合菌株对柑橘青霉病、梨黑斑病的抑制效果

5.3.4其他物质对拮抗菌防治柑橘青霉病、梨黑斑病抑制效果的影响

5.3.5拮抗酵母菌在果实伤口的生长动态

5.3.6病原菌对伤口处拮抗菌生长动态的影响

5.3.7拮抗菌处理对果实酶活性的影响

5.4讨论

6结论

致谢

参考文献

附录