蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白受体结合域在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达

摘要

目的：
　　 SARS冠状病毒表面的刺突蛋白(Spike，S蛋白) 可与宿主细胞上的病毒受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合，介导病毒进入细胞。S蛋白上的受体结合功能域（Receptor Binding Domain，RBD）是能与ACE2稳定结合的最小功能片段，在病毒的跨宿主传播中发挥了关键作用。
　　 在SARS冠状病毒溯源的研究中，研究人员在蝙蝠体内发现SARS样冠状病毒（Bat SARS-LcoV），但由于Bat SARS-LCoV不能在现有的细胞培养体系中有效扩增和分离，限制了直接利用活病毒对细胞或动物模型感染从而进行跨宿主传播机制的研究工作。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统对蝙蝠SARS样冠状病毒（Bat SARS-LcoV）S蛋白的RBD片段进行融合表达，并初步探索其表达动力学和纯化条件，旨在为进一步研究Bat SARS-Like-CoV在动物间的传播路线和跨种属传播机制提供实验基础，亦为进一步研究Bat SL-CoV S蛋白的抗原性和免疫原性提供基础材料。
　　 方法：
　　 1、pFAST-Bat-RBD供体质粒的构建：以蝙蝠SARS样病毒S蛋白基因第964-1542位核苷酸为目的片段设计引物，在反向引物上引入FLAG融合蛋白标签，通过PCR获取大量目的基因，并通过T-A克隆连接到pMD18-T载体，再通过亚克隆手段将目的基因正确插入到pFAST-HTB的多克隆位点，以构建出pFAST-Bat-RBD重组供体质粒。
　　 2、重组杆状病毒的产生和滴度测定：以重组供体质粒pFAST-BAT-RBD转化E.Coli DH10Bac感受态细胞，可使其所带的目的基因BAT-RBD与E.Coli DH10Bac细胞内的杆状病毒基因组（Bacmid）发生转座重组。将重组的杆状病毒基因组Bacmid-BAT-RBD转染sf9昆虫细胞，即可产生重组的杆状病毒。通过检测病毒的半数致死计量（TCID50），确定病毒的滴度。
　　 3、 重组蛋白BAT-S-RBD的产生和鉴定：用高滴度的病毒液以合适的感染复数（MOI）感染昆虫细胞，72小时后收集细胞和培养上清液作SDS-PAGE及Western Blot检测以明确蛋白表达的定位。并对重组蛋白的表达作时间和MOI优化，通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。
　　 结果：
　　 1、质粒pFAST-Bat-RBD经双酶切、PCR鉴定和基因测序，结果证实克隆的目的基因正确插入到供体质粒，其序列与蝙蝠SARS样病毒S蛋白基因964-1542片段完全吻合，提示供体质粒pFAST-Bat-RBD构建成功。
　　 2、重组杆状病毒基因组Bacmid-BAT-RBD的PCR检测结果表明，目的基因已正确插入到杆状病毒基因组中；细胞转染杆状病毒基因组后产生典型病变，以及稀释的培养上清液能使正常细胞产生相同病变，表明重组病毒成功产生；通过测定病毒的半数致死计量（TCID50），得出P1病毒的浓度为8.6×106 PFU/ml，P2病毒液的浓度为5.3×107 PFU/ml，P3病毒液的浓度为2.1×108 PFU/ml。
　　 3、SDS-PAGE及Western Blot检测结果表明，昆虫细胞感染重组杆状病毒后，成功产生了重组蛋白BAT-S-RBD，其分子量约26kDa，且重组蛋白只在细胞内表达，并不能分泌到培养基中。重组蛋白表达的最适合MOI为2；表达峰值在感染病毒56小时到64小时之间；可通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。
　　 结论：
　　 本研究成功构建了包含目的基因的重组杆状病毒，可以在昆虫细胞系中有效产生重组蛋白，并初步优化了重组蛋白的产生和纯化条件。为进一步研究蝙蝠SARS样冠状病毒在动物间的传播路线和跨种属传播机制提供了实验基础。亦为进一步研究Bat SL-CoV S蛋白的抗原性和免疫原性提供了基础材料。