吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达及纯化研究

摘要

本文对吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达及纯化进行了研究。文章在体外人工合成吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 Bat-PA (H) 的全长基因，并在基因序列5’和3’端分别引入His6，再将其克隆到表达载体pPIC9K上，成功构建出His6-Bat-PA/pIC9K和Bat-PA-His6/pPIC9K重组质粒。然后，将构建的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经过G418浓度梯度抗性筛选、小量表达后经SDS-PAGE电泳检测及纤溶平板测活，获得高拷贝高表达的Bat-PA酵母菌株。利用单一实验和正交实验对Bat-PA酵母菌株的发酵过程中的五个因素进行优化，获得一个较优的发酵表达条件：pH=5.5，补加甲醇量2.0％/24h，4∶1接种，96小时发酵，10/50通气量。通过甲醇诱导分泌型表达获得重组的带His-tag的Bat-PA蛋白，其分子量约为66KD。由于His-tag的存在，经过Ni<'2+>亲和层析柱纯化，最终可从每升发酵液中获得20-30mg目的蛋白，并利用纤溶平板法对纯化得到的蛋白进行纤溶活性分析。

目录

文摘

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第1章文献综述

1.1前言

1.2溶栓药物的研究进展

1.3吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂研究进展

1.4纤溶酶活性测定方法

1.5 Pichia pastoris外源基因表达系统

第2章绪论

2.1研究目的和意义

2.2研究范围和内容

第3章实验材料、仪器及方法

3.1实验材料

3.2主要仪器

3.3实验方法

第4章实验结果与讨论

4.1带His6重组质粒Bat-PA/pPIC9K的构建及鉴定

4.2带His-tag的Bat-PA大肠杆菌表达菌株的构建和筛选

4.3带His-tag的Bat-PA毕赤酵母工程菌的构建和筛选

4.4带His-tag重组Bat-PA的活性测定

4.5 P.pastoris工程菌表达重组Bat-PA的发酵条件优化

4.6 P.pastoris工程菌表达带His-tag重组Bat-PA的纯化

第5章结论与建议

参考文献

致谢

附 录