BmMITE-2l转座元件的适应性进化及对插入位点附近基因的影响

摘要

考古证据表明，家蚕由大约5，000年前的野桑蚕经历人工驯化而来。在古代，中国把蚕视为国宝，为了保护蚕丝生产的秘密，严厉禁止走私蚕或蚕卵到其它国家。这项禁令持续了几千年，直到养蚕技术传播到日本、中东及欧洲一些国家。作为鳞翅目昆虫的代表，家蚕是至今已知的唯一被人类完全驯化的经济类昆虫，也是进行遗传学研究的好材料。据统计，世界范围内家蚕资源共有约1000个品系。根据地理位置，历史上人为的将家蚕分为中系、日系、欧系和热带系统四大系统，同时野外也存在着丰富的野桑蚕资源，这为我们研究家蚕与野桑蚕之间的遗传多态性提供了有利的条件。西南大学蚕学与系统生物学研究所保存的家蚕基因库是目前世界上保存系统最多的基因库，这些家蚕品系为研究家蚕的适应性进化提供了丰富的遗传材料。
　　 随着近年来大规模的基因测序的发展，发现真核生物基因组中含有大量的重复序列，因此要研究真核生物基因组的进化和起源，就必须研究转座元件对宿主基因组的影响。转座元件是一种重复的DNA片段，能够在基因组中随机移动，进而改变宿主基因组的结构和功能。当转座元件跳跃而插入到某个功能基因时，就可能诱发产生突变，突变是没有方向的，对于单个个体来说大多数突变可能是有害的，而对于整个物种来说突变能够产生大量的遗传变异来适应多变的外界环境，进而加速物种的进化[1]。
　　 家蚕基因组中转座元件所占的比例和其它已测序真核生物相比，仅低于玉米、大麦、人和小鼠等，远高于昆虫中的果蝇和按蚊，占整个家蚕基因组的比例约40％[2]。家蚕基因组中的转座元件主要由short interspersed nuclear elements(SINEs)和Non-long interspersed nuclearelements(non-LTRs)组成[3]。另外，家蚕中miniature inverted-repeat transposable elements(MITEs)转座元件可以分为17个家族[2]。其中，Bombyx mori miniature inverted-repeattransposable element-2(BmMITE-2)家族在基因组中具有拷贝数多，同源性高和最近可能发生过爆发式扩张等特征。因此，本文使用生物信息学、群体遗传学和分子生物学的方法，对家蚕BmMITE-2家族及其插入位点附近区域进行深入系统的研究。主要研究结果如下：
　　 1、BmMITE-2家族在家蚕中的插入缺失多态性分析以家蚕转座元件BmMITE-2序列作为问询序列，在NCBI和SilkDB[4]的核苷酸数据库中进行Blastn同源性搜索，发现BmMITE-2插入在ecdysteroid-regulated16kDa protein precursor(5.16 kDa)、Capa-a protein(Capa-a)、methyltransferase、ubiquinone biosynthesis proteinCOQ7-like protein(COQ7-L)、glucose-6-pheshate isomerase(1g6p)五个基因中。除COQ7-L的插入位点是在5'UTR区域外，其余四个基因的插入位点都在3'UTR区域。根据这5个插入位点在基因组上的位置信息，在其两端设计引物，应用PCR技术来普查这5个插入位点在4个家蚕地理系统中的插入缺失多态性。并在此基础上分析了宿主种群的遗传关系。结果表明，在基因COQ7-L的5'UTR区域，所选用的116个家蚕品系中，BmMITE-2插入的品系有11个，仅占9.48％，并且都集中在中系和热带系统。剩余四个基因BmMITE-2插入品系基因型所占频率所占比例依次是：68.6％、71.95％、60.33％、55.32％。然后又选取16个野桑蚕品系进行插入缺失多态性分析，发现这些野桑蚕品系中，基因COQ7-L中没有发现插入，而其它的四个基因中都发现有插入。
　　 根据BmMITE-2家族的5个插入位点的种群多态性分析，我们可以得到除BmMITE-2在基因1g6p和COQ7-L外，BmMITE-2在其它插入位点的基因型分布基本都符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；各种群的遗传分化主要集中在种群内部，且在不同的插入位点分化程度也不一样；同时，对家蚕4个地理系统间的遗传距离和系统发生分析暗示家蚕四大系统间并无明显界限。
　　 2、BmMITE-2诱导的适应性插入对COQ7-L基因5'UTR区域中的BmMITE-2在不同家蚕和野桑蚕品系中插入缺失情况进行深入的研究。我们选取了10个插入品系，13个缺失品系。然后，对这23个家蚕品系中插入位点和距离插入位点前后2kb、5kb区域的侧翼序列进行克隆测序，发现BmMITE-2的插入品系序列多态性显著低于缺失品系。系统发生分析发现，插入品系和缺失品系分别聚类在一起。我们猜测这个结果可能是由BmMITE-2的插入而引起的；也有可能是由于这些插入是最近发生的，所以在该位点具有BmMITE-2插入的品系在亲缘关系上较近。为了解决这个问题，我们选取了部分品系对其线粒体CR区域序列进行发生分析，排除了第二种可能。
　　 通过RT-PCR的方法，检测插入和缺失品系中基因COQ7-L的时期和组织表达情况，结果表明插入和缺失品系中，该基因在时期表达没有明显的差别；但是在组织表达上，该基因的插入和缺失品系中有较大的差异，其中在缺失品系中的卵巢、丝腺、脂肪体、中肠和气管中没有表达，而在插入品系中均有表达。
　　 本文首次在家蚕中应用生物信息学及分子生物学的方法研究转座元件的群体多态性及适应性插入，另外，我们强调的是转座元件对基因调控的作用。这不但对我们理解物种的多态性有很大的帮助，而且对理解转座子的作用即增加基因的调控网络提供新的视角。