鱼皮降血压肽的制备及其降血压活性研究

摘要

高血压是当今困扰全球的一种心血管疾病,同时也是诱发冠心病心肾功能衰竭的最主要因素。它常伴有心脏,血管,脑和肾等器官器质性病变,是引发心,脑,肾和眼等多种并发症和导致中风,冠心病的一个重要危险因子。全世界每年因高血压而死亡的人数达1200万,在我国,高血压的发病率随着经济的增长也逐年增高,目前,我国有高血压患者近1亿,每年死于心血管病的人数达200万,已高居死亡原因的首位,高血压为其主要的危险因素。调查显示,在高血压患者中,发现血压升高的占25%,接受治疗的只占12%,而能有效控制血压的仅有3%,日本早在20世纪90年代就对降血压肽进行了深入的研究,我国高血压的防治任重而道远。来源于食物蛋白的降血压肽以其无毒副作用、安全性高且对血压正常者无降压作用,适合长期服用等特点受到了各个国家的关注。食用蛋白研制的降血压肽应用前景巨大,越来越成为降血压研究的一大亮点,目前,人们相继从发酵乳、葵花籽粕、杏仁蛋白、米糠蛋白等制备出了降血压肽,但是利用巴沙鱼皮生产降血压肽的报道却鲜有出现。
　　 巴沙鱼在分类上属鲇形目(Siluriformes)芒科(Pangasiidae)芒鲶属(Pangasiushaniltoa)芒鲇(Haniltoa),是湄公河流域特有的名贵高档经济鱼类。该鱼在生长过程中,腹腔内积累有三块较大的油脂,约占体重的58%。该鱼具有生长快、个体大、产量高、食性广、易饲养、肉质白嫩、味道鲜美、营养丰富、无肌间小刺、利于加工等优点。目前已在我国湖北省英山县繁育成功,对巴沙鱼的利用和加工主要集中在鱼肉方面,鱼皮、鱼骨等具有丰富营养价值的产品大都被直接丢弃或作为动物饲料。巴沙鱼皮中Pro含量较高,巴沙鱼皮胶原蛋白含量为74.83%,研究表明pro含量高的原料可能更有利于制备高活性降血压肽。
　　 本文以巴沙鱼皮为原料,再通过Box-Behnken设计响应面优化试验;以血管紧张素转化酶(Angiotensinconveningenzyme,ACE)抑制率为指标,从四种商业蛋白酶中筛选出复合蛋白酶进行酶解,制备高活性的降血压肽,选用超滤、葡聚糖凝胶层析色谱法、高效液相
　　 色谱法对酶解后的多肽进行纯化分离;最后将纯化后的多肽进行分析,为下一步人工合成降血压肽提供了实验依据。研究结果如下:
　　 (1)蛋白酶选择实验
　　 本试验选择碱性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶对脱脂后的巴沙鱼皮胶原蛋白进行酶解,以ACE抑制率作为指标,选出复合蛋白酶作为试验用酶。
　　 (2)巴沙鱼皮胶原蛋白酶解技术参数优化试验
　　 选酶结束后,分别进行了固液比、酶解时间、酶底比等单因素试验,在酶解单因素实验中,酶解时间选择1h,固液比选择1:7-1:9,酶底比选择200u/g,在此基础上设计Box-Behnken响应面试验,最后得出其最佳的酶解技术参数:酶底比:340μ/g、酶解时间:1.27h、固液比:1:7.7,在此条件酶解液的IC50=1.417mg/mL。
　　 (3)超滤分离纯化巴沙鱼皮降血压肽
　　 酶解液用20目滤膜过滤后,稀释五倍,所得滤液采用分子量为30KD的超滤膜进行初步分离,除去未水解的蛋白质、不溶底物、及多糖等大分子杂质。超滤气压(N2为载气)控制在0.2MPa左右,多次收集流出液,超滤膜上部大分子液体,将流出液和超滤膜上部大分子液体分别收集,冷冻干燥,测定分子量大于30KD,分子量小于30KD和酶解原液的IC50值,试验结果表明,分子量小于30KD的多肽降血压活性最高。
　　 (4)巴沙鱼皮降血压肽的葡聚糖凝胶和反式RP-HPLC纯化
　　 选用SephadexG-50葡聚糖凝胶层析对分子量小于30KD的多肽进行进一步纯化,得到2个吸收峰,分别对2各峰进行抑制率活性的测定,组分Ⅰ和组分Ⅱ的IC50分别为1.362mg/mL和0.699mg/mL,选择组分Ⅱ的多肽进行反式RP-HPLC纯化。
　　 (5)巴沙鱼皮降血压肽的理化性质分析
　　 巴沙鱼皮降血压肽在pH2-10范围内的溶解度变化幅度较小,显示较高的溶解度,溶解度均大于80%。降血压肽具有较强的吸湿性。在酸性条件下的乳化性比碱性条件下乳化性强,相反在pH接近5时,鱼皮降血压的稳定性较强。降血压肽在酸性和碱性和环境中均有很好的稳定性,降血压肽在高温加热和室温条件下都有很好的稳定性,鱼皮降血压肽经消化酶水解后活性变化不大。