重庆辣椒病毒病的病原鉴定及多重RT-PCR检测体系的构建

摘要

重庆是我国辣椒的主产区和集中消费区之一，近年来辣椒病毒病危害严重，严重影响产量和品质。为了弄清辣椒病毒病的主要毒原，本研究分别于2013年和2014年从重庆北碚、彭水、武隆、万州、石柱、巫山、巫溪、永川、九龙坡、涪陵、秀山及合川等12个区县采集了278份辣椒病毒病样品。利用烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wiltvirus2，BBWV-2)、番茄花叶病（Tomato mosaic virus，ToMV）及番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的特异性血清，采用斑点免疫杂交法(Dot-ELISA)进行检测。结果显示，从病毒总检出率来看，CMV的总检出率最高，达56.47％; TMV其次，为33.45％; TSWV的总检出率最低，仅为14.39％。辣椒上病毒病复合侵染现象普遍且类型多样，最主要的复合侵染类型包括TMV+CMV、TMV+TuMV及TMV+CMV+TuMV，其中TMV+CMV的总检出率最高，为14.38％。从各地区辣椒发病情况来看，石柱地区受病毒病侵染最严重，6种病毒的总检出率均超过30.00％。
　　根据Genbank中已登录的序列设计特异性引物，本研究建立了辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)、辣椒叶脉斑驳病毒(Chilli vein mottle virus，ChiVMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、TSWV及TuMV的RT-PCR检测体系。扩增得到了重庆辣椒上PMMoV、PVY及TSWV的CP基因序列和ChiVMV、TuMV的部分CP基因序列。序列测定及分析表明:PMMoV重庆分离物PMMoV-WL02与中国的2个分离物PMMoV-BD和Guizhou的相似性最高，为99.2％;ChiVMV重庆分离物ChiVMV-WZ07与中国苋色藜上分离物Pp3相似性最高，达99.8％％; PVY重庆分离物PVY-BB31与中国河北马铃薯上分离物HeB20相似性最高，为98.5％，属于PVY普通株系(PVYO); TSWV重庆分离物TSWV-SZ21与中国2个分离物CG-1和KM-T相似性最高，为99.6％，这4种病毒的系统进化均表现出一定的地理相关性。TuMV重庆分离物TuMV-WZ08与中国油菜上的分离物Baoji2和Xianyang3的相似性最高，达99.5％。
　　通过血清学和分子检测发现重庆地区辣椒普遍受TMV、CMV、TuMV、BBWV-2及PMMoV的侵染，且辣椒上病毒复合侵染现象复杂多样。本研究建立了同时检测TMV、CMV、TuMV、BBWV-2及PMMoV等5种主要辣椒病毒的多重RT-PCR体系，并对该检测体系的扩增条件和参数进行了优化。将单一RT-PCR检测结果与多重RT-PCR结果进行比对，证实了该体系检测结果的准确性，同时提高了检测效率，降低了检测成本，可用于田间大量样品的快速检测。
　　本研究运用Dot-ELISA和RT-PCR技术，明确了重庆地区辣椒病毒病的病原种类，其中，TuMV侵染辣椒在我国属首次报道，从辣椒上检出PMMoV、ChiVMV、PVY和TSWV是重庆地区的首次报道。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1 国内外辣椒病毒病毒源种类及危害

1．1 黄瓜花叶病毒

1．2 烟草花叶病毒

1．3 马铃薯Y病毒

1．4 烟草蚀纹病毒

1．5 马铃薯X病毒

1．6 苜蓿花叶病毒

1．7 蚕豆萎蔫病毒2号

1．8 辣椒轻斑驳病毒

1．9 辣椒脉斑驳病毒

1．10 番茄斑萎病毒

2 重庆辣椒病毒病研究现状

3 辣椒病毒检测及鉴定技术

3．1 生物学方法

3．2 电镜观察法

3．3 血清学方法

3．4 分子检测法

4 本研究的目的与意义

第二章 重庆辣椒病毒病样品的Dot-ELISA检测

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 辣椒病毒病的主要症状

2．2 辣椒样品的Dot-ELISA检测

2．3 不同年份采集样品的病毒检出率比较

3．讨论

第三章 辣椒病毒的分子鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 辣椒轻斑驳病毒的分子鉴定

2．2 辣椒脉斑驳病毒的分子鉴定

2．3 马铃薯Y病毒的分子鉴定

2．4 番茄斑萎病毒的分子鉴定

2．5 芜菁花叶病毒的分子鉴定

3 讨论

第四章 五种辣椒病毒多重RT-PCR检测体系的建立及应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 多重RT-PCR反应体系的优化

2．2 多重RT-PCR扩增条件的优化

2．3 多重RT-PCR体系检测灵敏度的测定

2．4 应用多重RT-PCR检测田间样品

3 讨论

结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

附录

致谢

在校期间发表论文及参加课题