梓醇对脑缺血大鼠脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及促神经元存活机制的研究

摘要

背景：脑卒中具有高发病率、高死亡率、高复发率、高致残率、高经济负担的特点，但临床上治疗脑卒中的药物相当匮乏。神经干细胞存在于成年动物及人类的这一事实使基于神经干细胞介导地神经新生成为治疗脑卒中的一大策略。虽然神经干细胞存在于成熟的中枢神经系统中，但中风后，梗死中心及其周围区域神经元大量死亡，内源性神经干细胞增殖不足，分化而来的神经元数量过少，加之仅有0.2％的新生神经元能存活下来，使得动物依靠自身地修复不能恢复原有的神经功能。因此，如何促进内源性神经干细胞增殖并向神经元方向分化，促进新生神经元存活下来，成为治疗脑卒中的关键。地黄是中医治疗脑中风的重要药物之一，既往研究表明，地黄的主要有效成分梓醇具有保护脑缺血神经元，促进离体人类脂肪组织来源干细胞向神经元方向分化的作用，而梓醇对在体动物神经新生的相关研究缺乏。本实验从梓醇干预永久性脑缺血损伤大鼠内源性神经干细胞入手，探讨梓醇对脑缺血大鼠脑内成体神经干细胞增殖分化地影响及新生神经元的存活机制，为缺血性脑血管病地治疗提供实验依据。
　　目的：
　　1.观察梓醇对永久性脑缺血大鼠缺血1d,3d,7d,14d,21d神经行为学功能的影响，考察梓醇对脑缺血动物模型的主要药效学结果。
　　2.观察梓醇对永久性脑缺血7天大鼠损伤侧 SVZ区和缺血区周围大脑皮质成体神经干细胞增殖分化的影响。
　　3.观察梓醇对永久性脑缺血大鼠神经元存活的影响，进一步探讨梓醇影响神经元存活的机制。
　　方法:
　　1.制备局灶永久性脑缺血大鼠模型，于造模后6h开始腹腔注射给予5mg/kg梓醇和10mg/kg梓醇进行治疗，每天给药一次。分别于造模后1、3、7、14、21天，进行Bederson神经功能评分、角落测试和跑梯测试评分，从神经行为学角度评价梓醇治疗脑缺血的药效。
　　2.采用免疫荧光双标染色，检测脑缺血7天大鼠损伤侧SVZ区及缺血周围区大脑皮质新生神经干细胞，新生神经元细胞，新生星型胶质细胞的数量；采用Western blot免疫印迹分析法，半定量分析各实验组损伤侧缺血周围大脑皮质区Tuj-1和GFAP蛋白表达的变化。
　　3.采用Western blot免疫印迹分析法检测梓醇对脑缺血7天、14天、21天大鼠缺血周围大脑皮质区Map-2蛋白表达的影响。观察脑缺血7天、14天大鼠缺血区周围大脑皮质区BDNF、TrkB、P-TrkB、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Cleaved-Caspase3蛋白表达的变化。
　　4.使用K252a抑制TrkB受体，采用尼氏染色观察梓醇和K252a对脑缺血大鼠缺血周围大脑皮质区神经元的影响；利用WB免疫印迹分析法，观察K252a对脑缺血7天大鼠缺血周围区大脑皮质Tuj-1，Map-2，BDNF、TrkB、P-TrkB、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。
　　结果：
　　1.脑缺血后各组大鼠体重的增长率降低，各时间点5、10mg/kg梓醇组大鼠体重均大于模型组，但无显著性差异。
　　2.随着时间地推移模型组、各梓醇组Bederson评分数逐渐降低，各时间点各梓醇组与模型组Bederson评分数无显著性差异；角落测试和跑梯测试评分结果显示，5、10mg/kg梓醇组均能改善脑缺血大鼠神经行为学功能评分。
　　3.大鼠脑缺血7天，损伤侧SVZ区和缺血周围区大脑皮质都存在细胞分裂增殖的现象，5mg/kg梓醇组和10mg/kg梓醇组均能显著促进脑缺血大鼠损伤侧SVZ区和缺血周围区大脑皮质细胞分裂增殖，其中5mg/kg梓醇组促增殖效果更明显。
　　4.大鼠脑缺血7天，5mg/kg梓醇组和10mg/kg梓醇组均能显著增加损伤侧SVZ区Nestin蛋白的平均光密度值，显著增加缺血周围大脑皮质区新生神经干细胞的数量。
　　5.大鼠脑缺血7天，5mg/kg梓醇组和10mg/kg梓醇组均能显著增加损伤侧SVZ区Tuj-1和GFAP蛋白的平均光密度值，增加缺血周围区大脑皮质新生神经元细胞和新生星型胶质细胞的数量，促进此区Tuj-1和GFAP蛋白的表达。
　　6.各梓醇组均能明显上调脑缺血7天、14天、21天大鼠缺血周围区大脑皮质Map-2蛋白的表达。大鼠脑缺血7天，各梓醇组均能显著上调缺血周围区大脑皮质BDNF蛋白含量，增加凋亡调控基因对Bcl-2/Bax蛋白比值，但Caspase-9蛋白的表达趋势不稳定；脑缺血14天，各梓醇组均能上调缺血区周围大脑皮质BDNF蛋白含量，增加Bcl-2/Bax蛋白量比值，降低Caspase-9和Cleaved-Caspase3蛋白的表达量。脑缺血7天、14天各组TrkB蛋白磷酸化率无显著性差异。
　　7.K252a组、K252a组与5mg/kg梓醇联合干预组、5mg/kg梓醇组和10mg/kg梓醇组均能改善脑缺血7天大鼠缺血周围区大脑皮质尼氏染色结果，促进缺血周围大脑皮质区 Tuj-1、Map-2、BDNF，TrkB，P-TrkB蛋白的表达，增加Bcl-2/Bax蛋白量比值，假手术组、模型组、各干预组TrkB蛋白磷酸化率无显著性差异。
　　结论：
　　1.梓醇能促进脑缺血大鼠神经行为学功能的恢复。
　　2.梓醇能促进脑缺血7天大鼠SVZ区和缺血周围区大脑皮质神经干细胞的增殖，促进其向神经元方向分化，促进星型胶质细胞的增殖。
　　3.梓醇能通过增加缺血区周围大脑皮质凋亡调控基因对Bcl-2/Bax的比值，从而降低Caspase家族凋亡启动亚类蛋白酶Caspase-9蛋白的表达，最终抑制死亡执行蛋白酶Caspase-3的激活，抑制半暗带神经元细胞的凋亡。此信号通路的启动与作用强弱可能与缺血时程有关，Caspase-9蛋白可能是梓醇调控此信号通路的关键蛋白。
　　4.梓醇可能不通过BDNF/TrkB信号通路抑制神经元细胞的凋亡。

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中文摘要

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前言

1. 脑卒中治疗现状

2. 神经新生策略治疗中风的希望与问题

3. BDNF与神经干细胞增殖，分化，凋亡的关系

4. Bcl-2/Bax, Caspase信号通路与凋亡的关系

5. 梓醇是治疗中风极具潜力的调控神经新生的药物

第一部分梓醇纯度的验证

1 材料与方法

2 结果

第二部分梓醇对局灶永久性脑缺血大鼠神经行为学功能的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分梓醇对局灶永久性脑缺血大鼠脑内成体神经干细胞增殖分化的影响

1材料与方法

2结果

第四部分 梓醇干预对局灶永久性脑缺血大鼠神经元存活的影响及机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

全文总结

创新点及意义

思考与展望

参考文献

文献综述:神经新生与脑卒中

致谢

硕士学位期间科研工作汇报

英汉缩略语名词对照