高迁移率族蛋白1在内毒素急性肺损伤中性粒细胞凋亡改变中的作用探讨

摘要

急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)发病机制尚未完全阐明。目前认为，ALI本质上可能是一种肺内过度性、失控性炎症反应，中性粒细胞(polymorphonucleargranulocytes，PMN)是参与此过度性炎症反应的重要炎症细胞。ALI时存在肺内PMN凋亡延迟现象，后者可能通过导致PMN产物延迟释放或直接损伤肺组织，参与ALI的发生。 高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupboxprotein1，HMGB1)最初被描述为一种参与DNA复制、修复、转录作用的DNA结合蛋白及介导轴突生长的膜结合蛋白。新近发现，HMGB1可能作为内毒素血症的晚期炎症介质发挥作用。HMGB1从活化的单核细胞释放，参与致死效应，且可激活下游细胞因子释放。作为一种致炎细胞因子，HMGB1对健康动物有致死效应。脓毒症患者血清HMGB1水平增高，在死亡患者中其水平达到高峰。HMGB1释放的延迟动力学显示针对该种毒性细胞因子的靶向处理对于未来治疗具有潜在意义。大量证据表明，HMGB1与延迟的内毒素致死性有关。但HMGB1在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的PMN凋亡延迟及抑制中的作用尚未阐明；HMGB1是否有助于ALI时细胞凋亡的改变也鲜有报道。而且，HMGB1表达与PMN凋亡间的交互关系及HMGB1对凋亡的调控能力尚属未知。本研究(1)应用大鼠内毒素肺损伤模型，动态观察ALI发生过程中HMGB1的变化与PMN凋亡的相互关系，以揭示HMGB1在内毒素ALI时PMN凋亡改变中的作用；(2)将白人外周血新鲜分离的PMN与不同浓度的HMGB1(10、100、1000ng/ml)37℃共孵育24h后，流式细胞术(flowcytometry，FCM)及末端脱氧核糖转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling,TUNEL)法检测其凋亡情况，以阐明HMGB1对PMN凋亡的影响。研究旨在探讨HMGB1对LPS诱导PMN凋亡改变的调控机制，拟为进一步阐明ALI的发病机制及临床防治ALI提供新的实验依据与理论基础。 研究内容：1.静脉注射LPS复制大鼠内毒素ALI模型。2.观察内毒素ALI大鼠外周血及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中PMN的凋亡变化。3.逆转录—聚合酶链反应检测大鼠ALI模型不同时相点肺组织HMGB1mRNA表达。4.检测大鼠ALI模型肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophage，AM)的吞噬功能变化。5.分析大鼠ALI模型肺组织HMGB1mRNA表达与外周血及BALF中PMN凋亡率的相关性。6.分析大鼠ALI模型AM吞噬功能与肺组织HMGB1mRNA表达的相关性。7.观察HMGB1合成抑制剂正丁酸钠(sodiumbutyrate，SB)对大鼠ALI模型PMN凋亡改变、AM吞噬功能、肺组织HMGB1mRNA表达的干预效应。8.体外不同剂量HMGB1与人PMN共孵育后检测PMN凋亡率。 结果：1.静脉注射LPS后，大鼠肺组织水肿及炎性病变程度明显加重，呈现典型的ALI病理改变。HMGB1合成抑制剂SB干预可减轻肺损伤程度。 2.LPS致伤后6h内，大鼠ALI模型PMN凋亡率逐渐下降，2h时相点由正常对照的64.82％±9.15％降至43.67％±3.82％(外周血)，2h、6h时相点降至53.24％±2.67％及15.65％±9.42％(BALF)(由于正常对照组BALF中以AM为主，几乎无PMN，故仍以外周血PMN作为基础值)；大鼠BALF中PMN凋亡开始时间及无细胞存活时间均延长，分别由对照组的(¨.5±2.9)h、(47.2±8.2)h延长至(18.4±3.5)h、(63.3±2.1)h。同时肺组织HMGB1mRNA表达上调，6h、24h时相点分别由正常对照的0.227±0.045上调至0.521±0.107及0.648±0.120。SB干预可减弱LPS诱导的PMN凋亡延迟及抑制，下调肺组织HMGB1mRNA的表达。 3.大鼠内毒素ALI模型6h、12h、24h时相点AM吞噬率分别由正常对照的(86.5±9.69)％降至(18.94±2.01)％、(12.64±2.01)％及(12.52±2.41)％；凋亡指数由正常对照的2.45±0.39降至1.3±0.15、1.34±0.02及1.3±0.41。相关性分析显示，AM吞噬功能与肺组织HMGB1mRNA表达之间呈显著负相关。 4.体外HMGB1(0、10、100、1000ng/ml)与人PMN共培养后行FCM检测，PMN凋亡率分别为(40.53±4.12)％、(40.52±2.73)％、(34.89±1.15)％、(18.77±3.02)％，TUNEL阳性率分别为(31.42±4.40)％、(31.39±3.80)％、(25.62±2.46)％、(17.98±3.20)％。 结论：1.本研究成功复制了大鼠内毒素ALI模型。 2.LPS致伤后大鼠肺组织HMGB1mRNA表达时相延迟，但其高水平表达维持较长时间；内毒素ALI时存在PMN凋亡抑制、凋亡时相延迟现象。HMGB1合成抑制剂SB处理可削弱大鼠内毒素肺损伤模型PMN凋亡抑制、延迟效应，同时肺组织HMGB1mRNA表达下调，提示HMGB1可能参与内毒素ALI时PMN凋亡改变。 3.LPS致伤可明显削弱大鼠AM吞噬功能。SB干预可部分消除LPS所致大鼠AM吞噬功能减退。AM吞噬功能与肺组织HMGB1mRNA表达的相关性分析表明，HMGB1高表达可能参与AM吞噬功能改变；AM吞噬功能减退可能是HMGB1参与ALI发生、发展的机制之一。 4.体外HMGB1可以剂量依赖方式显著抑制PMN凋亡。 上述研究表明：HMGB1对内毒素ALI时PMN的凋亡改变具有调控作用；HMGB1的这种作用可能与LPS诱导的AM吞噬功能改变相关联。上述调控作用可能是内毒素ALI的重要发病机制之一，针对HMGB1的靶向干预可能为ALI的临床防治带来新的曙光。

目录

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英文缩写一览表

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致 谢

照 片1

照 片2

参考文献

文献综述一：高迁移率族蛋白1的研究进展

摘要

概述

HMG蛋白的发现、命名、分类及基因定位

HMGB1的结构[14，18，19]、功能学研究

分布与表达

HMGB1受体

HMGB1的生物学功能

作用机制

信号转导通路

HMGB1与疾病

治疗意义及潜在应用价值

研究展望

参考文献

文献综述二：内毒素急性肺损伤与中性粒细胞凋亡改变

攻读博士期间发表的论文