PaP1 DNA聚合酶功能探索与酵母菌DNA聚合酶催化结构域跨损伤动力学研究

摘要

在病毒、原核、真核生物中，都包含有DNA聚合酶，它是DNA复制过程中较为重要的酶。噬菌体作为病毒，在其侵染宿主细菌、进行增殖的过程中，以及在噬菌体自身的DNA复制过程中，都有DNA聚合酶的参与，并起到至关重要的作用。然而，对于噬菌体中的DNA聚合酶的认知是有限的，许多噬菌体中的DNA聚合酶的工作机理并不清楚，很多潜在的功能还待挖掘。对于较为复杂的真核生物来说，DNA聚合酶在其机体的正常运转与生命延续中也承担了重要的角色，对于自身基因的变异和外界环境的刺激影响，DNA聚合酶都能够辅助机体继续完成DNA复制、跨损伤与修复，它是生命遗传物质DNA进行精确复制的保障。
　　生命体中许多疾病都与遗传基因DNA的损伤相关，DNA损伤会造成DNA序列永久性的改变，从而产生疾病，导致遗传特征的改变、功能丧失、畸形甚至死亡。机体本身会有自发性的变异，致使DNA复制时发生错配、碱基发生改变等;同时在自然界中接触到的物理性、化学性致损伤因素，也会导致DNA序列以及碱基发生突变，例如紫外线、电离辐射、烷基化试剂等等。DNA损伤所导致的疾病严重危害着人类的健康，通过研究DNA跨损伤复制以及修复等的机理，将为相关疾病的治疗奠定基础。
　　铜绿假单胞菌噬菌体(Pseudomonas aeruginosa phage) PaP1作为一种新型的强制病性菌噬菌体，它的DNA聚合酶参与DNA复制的机理尚未研究，本课题组通过分离纯化PaP1噬菌体，构建载体，表达纯化PaP1噬菌体的DNA聚合酶Gp90，应用生物信息学对这种DNA聚合酶的功能进行预测，并通过实验完成功能的验证。同时，本课题组也对真核生物酵母的DNA聚合酶催化结构域Polηcore进行研究，分析其通过O6-MeG DNA损伤的动力学过程。研究的内容和结果如下:
　　1.噬菌体PaP1的DNA聚合酶Gp90的功能鉴定:通过对gene90进行片段扩增，连接到表达载体上，转化到大肠杆菌中，大量表达目的蛋白Gp90，裂解菌体后，超速离心，通过Ni柱纯化蛋白，得到具有酶活性的DNA聚合酶Gp90。PaP1噬菌体的DNA聚合酶Gp90属于A-类DNA聚合酶，它同时具有聚合酶活性和3'-5'的外切酶活性。采用生物信息学方法对Gp90的功能进行了预测，并与同类的其它DNA聚合酶在聚合酶区域和外切酶区域分别进行了功能比对，发现Gp90的序列与其它A-类DNA聚合酶（例如T7 DNA Pol和E.coli DNA PolⅠ）具有同源性但并不完全一致。通过同位素标记DNA的方法检测了DNA聚合酶和外切酶活性。聚合酶活性的检测采用双链DNA全长延伸反应、M13长链DNA的延伸反应、单点插入实验，发现Gp90可持续进行DNA复制，具有较高的延伸性，并且其DNA延伸能力与单个dNTP插入效率都类似于T7 Pol/trx。采用单链DNA和双链DNA验证外切酶活性，发现Gp90能够从3'到5'方向剪切单链DNA和双链DNA，与T7 Pol/trx的速率相似，但低于T7 Pol/trx的效率。最后，优化并确定Gp90聚合反应的最佳反应条件为:40 mM Tris-HCl(pH8.0)，30 mMMgCl2，200 mM NaCl，反应温度为37℃。这些关于PaP1 DNA聚合酶的发现都有利于我们增强对噬菌体中所编码的DNA聚合酶的认知，同时也增强理解PaP1感染铜绿假单胞菌的增殖过程。
　　2.酵母菌的DNA聚合酶催化结构域Polηcore跨过O6-MeG损伤的动力学分析:选择Polη的催化结构域Polηcore，检测其通过O6-MeG DNA损伤的动力学过程。与全长DNA聚合酶Polη（残基1-632）相比较，Polηcore仅含有N端1-513个氨基酸，缺少参与蛋白相互作用的C端C2H2结构域，因此更能体现出该聚合酶通过DNA损伤的本征活性。首先采用四种dNTP存在下的全长延伸反应、稳态单个dNTP插入反应和下一位碱基的延伸反应、稳态前dCTP的插入反应以及液相色谱串联质谱技术分析所有延伸产物的序列。Polηcore催化下，在正常G上的错配率为10-4，在O6-MeG上的错配率为0.055-0.446。O6-MeG并不影响下一位碱基的延伸效率。在G与O6-MeG上插入dCTP时没有出现快速动力学过程，说明dCTP插入过程中的化学反应步骤不会快于随后的DNA和聚合酶解离的速率。当遇到O6-MeG时，引物的延伸被显著阻断，大约有67％的dTTP，31％的dCTP和2％的dATP插入到O6-MeG的对位。这些研究为深入理解酵母菌DNA聚合酶在跨过烷基化损伤时的分子机制提供了重要价值。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 PaP1 DNA聚合酶聚合与外切功能探索

2．1 材料方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 酵母菌DNA聚合酶催化结构域跨过O6-MeG DNA损伤的动力学研究

3．1 材料方法

3．2 实验结果

3．3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 DNA聚合酶工作机制的研究综述

攻读学位期间发表论文

致谢