ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和骨关节炎中的作用及机制研究

摘要

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是最常见的关节退行性疾病。骨关节炎基本病理特征包括进行性关节软骨纤维化及退变，滑膜炎性浸润和增生，骨赘形成及软骨下骨硬化。随着病情进展患者出现移动性疼痛，关节僵直，行动受限甚至造成终生残疾。然而OA的致病尚未完全阐明，目前还没有有效的干预手段延缓或治愈OA。 关节软骨是一种无血管和神经支配的高度特化的纤维结缔组织。关节软骨覆盖关节表面，可减少关节面间摩擦和机械损伤。关节软骨细胞外基质包括II型胶原（type II collagen，Col II）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan，ACAN）。在病理情况下如OA发生中，细胞外基质蛋白可以被多种蛋白酶降解，其中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase)如MMP3、9、13和蛋白聚糖酶如adamts4 和adamts5主要参与软骨基质降解。软骨细胞是关节软骨中最主要细胞类型，通过分泌软骨细胞外基质及蛋白酶类降解多余的软骨基质降解维持软骨细胞外基质代谢平衡，参与关节软骨稳态维持，并受多种生长因子、细胞因子和机械刺激所调控。一旦软骨细胞受损失去维持关节软骨稳态的能力将导致软骨退变并最终引起 OA。虽既往研究显示多种生长因子和及下游信号通路如低氧诱导因子信号通路(Hif)、Wnt/β-连锁蛋白（Wnt/β-catenin）及成纤维生长因子/受体（FGFs/FGFRs）信号通路通过调控软骨细胞参与关节软骨稳态维持和OA发生发展。但OA发生的详细机制仍未完全阐明，进一步阐明调控软骨稳态和OA发生发展的分子机制将有助于开发和筛选有效的OA生物治疗药物。 近年来，转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）信号通路在软骨稳态维持中的作用越来越受到重视。在经典的Smad依赖的TGF-β信号通路中，TGF-β配体首先与II型TGF-β受体（TGF-βRII）结合，然后TGF-βRII募集I 型TGF-β受体（TGF-βRI） （又称为活化素受体样激酶 5，ALK5）至膜上形成异源四聚体起始 TGF-β 信号通路。在TGF-β配体作用下，自身磷酸化并激活的TGF-βRII磷酸化ALK5，活化的ALK5特异性识别结合并磷酸化激活型Smad蛋白（Smad2和Smad3），激活的Smad2/3与受体解离与胞浆内 Smad4 结合，形成 Smad 蛋白异源复合物。Smad 蛋白复合物共同入核结合核内相应转录因子启动TGF-β靶基因的表达。在Smad非依赖的TGF-β信号通路中，TGF-β与TGF-βRⅡ和ALK5受体结合后通过Smad非依赖方式激活MAPK、PI3K/AKT和GTPases下游信号通路。 遗传水平干预TGF-β信号通路中重要组分的研究表明TGF-β信号失调将导致OA发生。骨组织过表达显性负突变的TGFβRII（DN- TGFβRII）转基因小鼠或软骨细胞可诱导敲除TGFβRII的小鼠，在TGFβRII受体水平抑制TGF-β信号，软骨细胞中MMP13和Adamts5蛋白表达水平升高，最终小鼠关节出现进行性加重的OA样表型。与此类似的，全身或软骨细胞内特异敲除Smad3基因，在Smad3水平抑制TGF-β信号，可降低软骨细胞内Col II和ACAN表达，上调MMP13和X型胶原（Col X）表达最终导致小鼠出现模拟人OA样的软骨退变表型。基于以上研究结果，我们认为软骨细胞中TGF-β/TGFβRII-Smad3信号轴在关节软骨稳态维持和OA发生发展中发挥重要作用。 然而，作为TGF-β信号通路中重要组分，ALK5及其下游信号通路在软骨稳态维持中作用尚未完全阐明。ALK5 在人和小鼠关节软骨中均有表达，并且随着年龄增加和 OA 发生，关节软骨中ALK5蛋白表达水平逐渐降低。体外软骨细胞中过表达ALK5增加Aggrecan mRNA表达水平，而软骨细胞中敲低Alk5基因则上调Mmp13 mRNA表达水平。关节腔注射ALK5阻断剂SB-505124明显促进软骨表层到中层软骨基质的丢失。这些结果提示软骨细胞中 ALK5 信号可能通过促进软骨基质合成并抑制其降解维持关节软骨细胞代谢平衡。然而ALK5信号在关节软骨稳态维持和OA发生发展中的作用仍然缺乏遗传学证据。 本课题首先利用可诱导软骨细胞特异性敲除Alk5基因的策略研究软骨细胞中ALK5信号通路在关节软骨稳态维持和OA发生中的作用，我们发现软骨细胞内ALK5信号可部分通过PKA/CREB依赖的信号通路上调软骨细胞内蛋白聚糖4 (Proteoglycan 4，PRG4）表达参与关节稳态维持和延缓OA发生发展。 PRG4又称润滑素(Lubricin)或表层蛋白(Superficial Zone Proteins，SZP)，主要由关节软骨表层区细胞分泌。关节软骨表层区由于其表层分布位置，特定的结构和功能构成了防止OA 起始的第一道防线。关节软骨表层由两到四层扁平状关节软骨表层细胞沿关节面平行排列而成，关节软骨表层细胞分泌特殊的细胞外基质蛋白如PRG4和肌糖蛋白，并形成特定的胶原纤维网络平行分布于关节表面。关节表层具有多种功能包括：分泌润滑素，携带软骨干/祖细胞以及抵抗剪切力等。TGF-β配体及受体在关节表层细胞内均有表达，TGF-β处理软骨表层细胞明显上调软骨表层标志基因PRG4的表达，软骨表层细胞Micromass培养并给予TGF-β处理能明显诱导PRG4和软骨基质蛋白如Col2 和 Aggrecan表达，表明软骨表层细胞具有向软骨分化的软骨干/祖细胞特性，同时 TGF-β 信号能明显诱导具有软骨干/祖细胞特性的表层细胞向软骨细胞分化，提示 TGF-β 信号在促进表层细胞标志基因的表达和促进具有干/祖细胞特性的表层细胞向软骨细胞分化过程中发挥重要作用，然而目前仍然缺乏遗传学证据。本课题利用可诱导关节软骨表层细胞特异性敲除Alk5基因的策略研究表层细胞中ALK5信号通路在关节软骨表层功能维持和OA发生中的作用。我们发现表层细胞内ALK5信号对关节软骨表层功能维持和延缓OA进展至关重要，进一步调控软骨表层中ALK5信号可作为OA治疗的新的靶点。 研究方法： 第一部分：软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因导致小鼠出现进行性加重的骨关节炎样改变 1. 出生后可诱导性敲除软骨细胞的Alk5 基因：Alk5flox/ flox ; Col2α1-CreERT2（简称Alk5Col2ERT2）和 Alk5flox/flox （Cre-Negative）小鼠均于出生后2周腹腔连续五天注射他莫昔芬（1mg/10g体重小鼠）驱动软骨细胞内Cre表达，实现软骨细胞内可诱导性敲除Alk5基因（此后称为Alk5 cKO小鼠）。免疫组织化学检测ALK5及下游靶分子pSmad3在2月龄Alk5 cKO和Cre-Negative小鼠关节软骨中表达。 2. 2、3、6月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节切片行藏红固绿染色观察软骨、滑膜及软骨下骨组织形态学变化。参考关节炎研究学会（Osteoarthrisits Research Society International，OARSI）推荐方法对软骨退变程度进行评分。 3. 定量PCR、WB和免疫组化检测Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨细胞中软骨基质合成和降解相关分子的表达。 4. TUNEL和活化的caspase 3免疫组化检测2月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨细胞的凋亡情况。 5.HE染色检测3月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠滑膜组织形态学变化。 6. 检测ALK5信号对关节软骨细胞中PRG4表达水平的影响 1) 免疫组化检测2月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨PRG4表达水平。 2) 定量PCR检测Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨中Prg4表达水平。 3) 关节软骨细胞给予不同浓度的ALK5抑制剂SB-505124（0.1，0.5 和1μM）处理24小时或1μM SB-505124处理不同时间点（6，12 和24 小时）后行定量PCR检测Prg4 mRNA表达变化。 7. 检测软骨细胞中ALK5信号在TGF-β1诱导的PRG4表达中的作用 1) 关节软骨细胞给予逐渐增加浓度的TGF-β1（5，10 和 20ng/ml）处理 24 小时或10ng/ml TGF-β1处理不同时间点（6，12 和24 小时）后行定量PCR和WB检测PRG4表达变化。 2) 关节软骨细胞给予1μM SB-505124预处理30分钟后，给予10ng/ml TGF-β1、1μM SB-505124或二者联合处理24小时后行定量PCR和WB检测PRG4的表达变化。 3) Cre-Negative和Alk5敲除的关节软骨细胞给予10ng/ml TGF-β1处理24小时后行定量PCR检测Prg4 mRNA的表达变化。 4) 关节软骨细胞转染持续激活的ALK5过表达载体和空白载体，转染12小时后给予1μM SB-505124继续处理12小时后行定量PCR检测Prg4 mRNA的表达变化。 8. 检测软骨细胞中PKA-CREB信号在TGF-β1/ALK5信号通路诱导的PRG4表达中的作用 1) 关节软骨细胞给予10μM PKA抑制剂H89预处理30分钟后，给予10ng/ml TGF-β1、10μM H89或二者联合处理24小时后行定量PCR和WB检测PRG4表达。 2) 关节软骨细胞给予10μM H89或1μM SB-505124预处理30分钟后，给予10ng/ml TGF-β1、10μM H89/1μM SB-505124或二者联合处理30分钟后行WB检测磷酸化CREB水平。 3) Cre-Negative和 Alk5 敲除的关节软骨细胞给予 10ng/ml TGF-β1处理 30分钟后行WB检测磷酸化CREB的表达。 4) 免疫组化检测2月龄Cre-Negative和Alk5 cKO小鼠关节软骨磷酸化CREB表达水平。 5) 关节软骨细胞给予10 μM CBP-CREB结合抑制剂预处理30分钟后，给予10ng/ml TGF-β1、10μM CBP-CREB结合抑制剂或二者联合处理24小时后行定量PCR和WB检测PRG4的表达。 5) 梯度浓度的PKA/CREB 激动剂弗斯可林 (Forskolin，FSK)处理 24 小时后行定量PCR检测Prg4 mRNA的表达变化。 第二部分：ALK5 信号在关节软骨表层细胞表型功能维持及骨关节炎中的作用及机制研究 1. 出生后可诱导性敲除关节软骨表层细胞中的Alk5基因：Alk5flox/flox; Prg4GFPCreERT2/+(Alk5prg4ERT2) and Alk5flox/flox (Cre-Negative)小鼠均于出生后20天腹腔连续10天注射他莫昔芬（1mg/10g 体重小鼠）驱动关节软骨表层细胞内 Cre表达，实现可诱导的关节软骨表层细胞敲除Alk5基因（此后称为Alk5 pcKO）。免疫组织化学检测ALK5及下游靶分子pSmad3在2月龄Cre-Negative和Alk5 pcKO和小鼠关节表层中表达。 2. 4和8月龄Cre-Negative和Alk5 pcKO小鼠关节切片行藏红固绿染色观察年龄相关的关节软骨组织形态学变化。 3. 2月龄雄性Cre-Negative和Alk5 pcKO右侧膝关节制作内侧半月板不稳定手术模型诱导小鼠发生关节炎，左膝关节仅打开内囊作为假手术对照组。术后8周取材后切片行藏红固绿染色观察手术诱导的关节软

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