快速发酵虾酱抗氧化活性的研究

摘要

虾酱是一种具有悠久历史的水产调味品，因其特有的风味和丰富的营养价值，在我国及东南亚地区备受欢迎。然而传统虾酱发酵工艺生产周期较长的弊端一直是制约虾酱产业化的瓶颈，所以研究快速发酵技术就显得十分必要;此外，虾酱具有降胆固醇、益菌、降血压、抗氧化等生物活性，特别是抗氧化活性，虽有诸多研究，但是对虾酱中发挥抗氧化活性的组分研究相对较少。因此，为了完善虾酱发酵在功能性方面的研究，进一步推动传统发酵调味料产业的发展，本论文以现代发酵手段外加微生物法进行虾酱发酵，通过DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和还原力三种体外抗氧化活性检测指标对虾酱发酵过程中抗氧化活性的变化规律进行了分析;同时，也分析了发酵过程中外加发酵剂在虾酱抗氧化活性方面所表现出的相互作用;最后利用Capto Q-FF强阴离子交换柱和ODS C18柱，藕联超高效液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)对虾酱中的抗氧化肽进行分离、纯化及结构鉴定;主要结果如下:
　　(1)虾酱发酵过程中营养组分及抗氧化活性的变化。通过外加微生物法和模拟传统虾酱手段发酵虾头制得两类虾酱，对比发酵前后，传统发酵虾酱中氨基态氮含量从0.23 g/100g增加到了0.58 g/100g，挥发性盐基氮含量从13.6 mg/100g上升到了43.6mg/100g;而快速发酵虾酱氨基态氮含量从0.38 g/100g增加到了0.84 g/100g，挥发性盐基氮含量从17 mg/100g上升到了50.1 mg/100g;再加之蛋白质、脂肪含量的变化，表明快速发酵虾酱明显能够在较短时间内将蛋白质水解，缩短发酵周期。
　　同时，对比发酵前后，传统发酵虾酱的羟自由基清除能力从52％增加到了86％，而快速发酵虾酱的羟自由基清除能力从54％增加到了75.2％。此外，两类虾酱的DPPH自由基清除能力和还原能力也都有增加。
　　(2)虾酱发酵过程中微生物产蛋白酶与抗氧化活性关系的分析。分别利用单菌乳酸菌、酵母菌（Pichia gilliermondii）及黑曲霉(Aspergillus niger)作为发酵剂，双菌乳酸菌和酵母菌、乳酸菌和黑曲霉、酵母菌和黑曲霉作为发酵剂，复合菌（乳酸菌、酵母菌、黑曲霉）作为发酵剂，进行虾酱发酵，发现单菌发酵体系、双菌发酵体系和复合菌发酵体系中的蛋白酶以中性蛋白酶为主。
　　以DPPH自由基清除率为指标分析虾酱体系中微生物间相互作用，发现乳酸菌的添加对酵母菌没有影响，但对黑曲霉却具有协同作用;酵母菌的添加对乳酸菌也没有影响，但对黑曲霉却具有协同作用;而黑曲霉的添加对乳酸菌和酵母菌菌具有抑制作用。根据虾酱体系蛋白酶酶活与DPPH自由基清除率变化规律，发现虾酱的DPPH自由基清除能力与蛋白酶酶活力正相关。
　　(3)快速发酵虾酱中抗氧化肽的分离、鉴定。选择Capto Q FF强阴离子交换从虾酱水提液中分离出6个活性组分(P1-P6)，其中检测到峰5(P5)具有较高的ABTS自由基清除能力;对该组分进一步用反相柱ODS C18纯化后，进行超高效液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱分析，初步鉴定该物质为二肽Trp-Pro，分子量m/z302.1411Da。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 虾酱简介

1．2 虾酱的发酵技术及其功能性

1．2．1 虾酱发酵技术

1．2．2 虾酱的生物活性

1．3 氧化损伤及虾酱的抗氧化作用

1．4 微生物产酶对发酵食品的作用

1．5 抗氧化肽的分离及活性评价

1．5．1 抗氧化肽的分离、纯化及结构鉴定

1．5．2 抗氧化活性的评价方法

1．6 立题背景及意义

1．7 主要研究内容

2 虾酱发酵过程中营养组分及抗氧化活性的变化

2．1 前言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 主要仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 菌株的驯化

2．3．2 虾酱制备

2．3．3 感官评价方法

2．3．4 营养及理化成分测定

2．3．5 不同溶剂提取虾酱

2．3．6 DPPH自由基清除率

2．3．7 羟自由基清除率

2．3．8 还原力测定

2．4 数据处理

2．5 结果与分析

2．5．1 感官评价

2．5．2 虾酱主要营养成分的变化

2．5．3 挥发性盐基氮测定(TVB-N)

2．5．4 不同溶剂提取虾酱的DPPH清除率

2．5．5 发酵过程中水提物的抗氧化性变化

2．6 本章小结

3 虾酱发酵过程中微生物产蛋白酶与抗氧化活性关系的分析

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 主要仪器

3．3 试验方法

3．3．1 单菌发酵虾酱制备

3．3．2 双菌发酵虾酱制备

3．3．3 复合菌发酵虾酱制备

3．3．4 蛋白酶酶活力测定

3．3．5 各类虾酱粗酶液制备

3．3．6 DPPH自由基清除率测定

3．4 数据处理

3．5 结果与讨论

3．5．1 不同微生物发酵剂发酵虾酱发酵过程中产各类蛋白酶酶活力

3．5．2 虾酱体系中各微生物间相互影响

3．5．3 虾酱中性蛋白酶酶活力与DPPH自由基清除率关系分析

3．6 本章小结

4 快速发酵虾酱中抗氧化肽的分离、鉴定

4．1 前言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 虾头发酵虾酱的制备

4．3．2 虾酱水提物制备

4．3．3 虾酱原液分子量分布

4．3．4 ABTS自由基清除实验

4．3．5 虾酱抗氧化多肽的分离、纯化

4．4 数据处理

4．5 结果与讨论

4．5．1 虾酱水提液分子分量布

4．5．2 Capto Q FF强阴离子交换柱分离条件优化

4．5．3 Capto Q FF强阴离子交换柱梯度洗脱条件优化

4．5．4 梯度洗脱出峰及各峰ABTS自由基清除率

4．5．5 ODS-C18柱分离条件的摸索

4．5．6 超高效液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF／MS)分析

4．6 本章小结

5 全文结论、创新点及展望

5．1 结论

5．2 论文主要创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

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