通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤后Nestin、bFGFmRNA的影响

摘要

脑缺血是临床上常见的急性脑血管疾病，具有高致残率、高致死率。如何积极有效地促进脑缺血患者神经功能的恢复仍然是目前脑缺血研究的重点。近十几年来，人们发现在成年脑组织内存在具有多种潜能的神经干细胞(NSC)，能增殖分化，可在一定条件下分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，改变了以往认为中枢神经系统神经元不能再生的认识。大量研究表明，神经干细胞(NSC)在神经营养因子和内环境的调控下可对因缺血损伤而造成的神经功能丧失产生代偿和修复作用。当前，有关中医药对脑缺血损伤后内源性神经干细胞增殖分化的影响已成为研究的热点，中医药促进脑缺血后神经功能的恢复作用是否与其诱导脑缺血后NSC的增殖分化有关?这为我们阐明中药促进脑缺血损伤后脑功能重建和再生机制，开发具有诱导脑缺血后内源性NSC的增殖分化的中药提出了新的研究思路。通心络对脑缺血损伤后内源性神经干细胞的增殖分化作用的研究尚未见到，本实验就此作一初步研究。 大量研究表明，神经干细胞(NSC)在神经营养因子和内环境的调控下可对因缺血损伤而造成的神经功能丧失产生代偿和修复作用。而巢蛋白(neuroepithelialstemcellprotein，Nestin)作为一种在神经干细胞中特异表达的类中间丝蛋白，在发育过程中的神经胚胎形成阶段、在神经内皮干细胞中特异性、一过性表达，神经前体细胞在进行神经元和星形胶质细胞的终末分化之后表达下调，并立即表达神经丝(neurofilament,NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。因此,Nestin被认为是神经前体细胞的标志，已广泛用于NSC的鉴定。因此，探讨脑缺血损伤后Nestin阳性细胞的形态、分布、数目的时程变化，有助于了解脑缺血后的神经修复机制。BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在细胞增殖周期的S期作为底物参与DNA的合成，嵌入细胞核DNA中，可被用于细胞增殖的标记。因而BrdU阳性细胞可被看作是具有增殖活性的细胞。本实验采用大鼠缺血再灌注损伤(MCAO)模型，应用免疫荧光双标方法观察缺血后3、5、7、14、21以及30d缺血侧室管膜及室管膜下区(SVZ)、海马齿状回(SGZ)神经干细胞的增殖分化变化。实验显示：大鼠脑缺血再灌注后各个时间段活动较假手术组减少，体重减轻；免疫组化双标显示各时段对照组BrdU阳性细胞主要分布在缺血侧皮质、海马(以颗粒层和齿状回更为明显)、室管膜上皮细胞及室下区、脉络丛上皮细胞等；部分BrdU阳性细胞同时呈Nestin染色阳性；随缺血再灌注时间的延长，荧光强度值增加，其中造模后第7天大鼠海马颗粒层和齿状回BrdU阳性细胞荧光强度值最高；第14天时室管膜上皮细胞及室下区、脉络丛上皮细胞的BrdU阳性细胞荧光强度值最高；但造模后第21天时，BrdU阳性细胞荧光强度和BrdU+Nestin免疫双标荧光强度值下降，但仍高于第3天时的强度值。给予通心络治疗后第3天缺血侧海马、室管膜及室下区BrdU+Nestin免疫双标荧光强度值：通心络大小剂量组、模型对照组及假手术组间比较有显著差异(SGZ区：P＜0.05；SVZ区：P＜0.05=；通心络治疗后第3、5、7、14、21、30天时海马、室管膜及室下区BrdU+Nestin免疫双标荧光强度值不同时间点间比较有显著差异(SGZ区：P＜0.05；SVZ区：P＜0.05=；其中通心络大剂量组第3、5、7、14、21、30天时荧光值均高于通心络小剂量组。通心络治疗5天起，缺血侧海马区、室管膜和室下区神经干细胞开始大量增殖，第14天达最高峰，第21天已下降，但神经干细胞仍在增殖并持续到缺血后第30天，而以通心络大剂量组效果最为明显。 近年研究表明，神经干细胞通过移植或体内激活，在所在的微环境作用下，发生增殖与分化，在神经干细胞的增殖、分化过程中，外源性因素如生长因子、细胞因子等对其具有重要影响。已知在胚胎干细胞中，碱性成纤维生长因子(bFGF)对细胞分化起着不可忽视的作用，bFGF能使分化的细胞保持良好的状态，并能诱导胚胎干细胞向神经胶质细胞分化。bFGF又是重要的神经营养因子，在维持大脑正常生理功能中发挥重要作用。本实验采用逆转录集合酶链式反应(RT-PCR)检测了缺血再灌注损伤后bFGFmRNA的变化，结果显示：假手术组几乎检测不到bFGFmRNA的表达；大鼠脑缺血再灌注后在病灶对侧仅见bFGFmRNA有少量表达。缺血再灌注模型组病灶侧bFGFmRNA在不同时间段均有表达，bFGFmRNA在造模后第3天开始表达增强，随缺血再灌注时间的延长，PCR表达增加，其中造模后第5天表达值最高，与其它时间点相比，统计学处理有显著差异(P＜0.05)；但造模后第14天时，PCR表达值下降；第30天恢复到基线水平。给予通心络治疗后第3天缺血侧bFGFmRNA表达开始增强，通心络大小剂量组病灶侧、缺血再灌注模型组病灶侧及缺血再灌注模型组病灶对侧间比较有显著差异(P＜0.05)；通心络治疗后第3、5、7、14、21、30天时bFGFmRNA表达不同时间点间比较有显著差异(P＜0.05)；表明通心络治疗第3天起，缺血侧神经干细胞相关细胞因子bFGFmRNA表达开始大量增殖，其中造模后第5天最高，第7天已下降，但bFGFmRNA仍有表达并持续到缺血后第30天。其中通心络大剂量组第3、5、7、14、21、30天时bFGFmRNA表达与通心络小剂量组比较无显著差异。 通心络是根据祖国医学络病学说而研制的复方中药制剂，由人参、蜈蚣、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、赤芍、冰片等组成具有益气活血、通络解痉之功效，临床上有明显促进神经功能康复的功效。通心络组大鼠缺血侧Nestin阳性细胞于造模后5d开始大量增殖，第14d达最高峰，第21d开始下降，并一直持续到缺血后第30天。bFGFmRNA表达上调早于Nestin阳性细胞的大量增殖时间点，bFGF可能为促进Nestin阳性神经干细胞增殖的因素之一。此外bFGF还具有神经保护作用，抑制细胞凋亡，促进神经元轴突的生长，bFGF能减少自由基损害，保护神经元，缓解神经损伤。因此bFGF是一类有多种生物学活性的蛋白质。它的功能涉及到刺激神经干细胞增殖和维持其存活，促进成纤维细胞和血管的再生、神经保护等许多方面。通心络对促进缺血再灌注脑损伤大鼠脑神经干细胞增殖，大剂量组效果优于小剂量组。而通心络大剂量组第3、5、7、14、21、30d时bFGFmRNA表达与通心络小剂量组比较无显著差异。这说明通心络除了使bFGFmRNA表达上调以外，还应有其他的机制刺激Nestin阳性细胞的增殖分化(有待进一步研究)，从而实现通心络对脑缺血再灌注损伤的治疗作用。 结论 1.通心络能促进缺血再灌注脑损伤大鼠脑神经干细胞增殖。 2.通心络治疗5d起，缺血侧海马区、室管膜和室下区神经干细胞开始大量增殖，第14d达最高峰，第21d已下降，并可持续到缺血后第30d。 3.通心络对促进缺血再灌注脑损伤大鼠脑神经干细胞增殖，大剂量组效果优于小剂量组。 4.缺血再灌注模型大鼠病灶侧bFGFmRNA在不同时间段均有表达，bFGFmRNA在造模后第3天开始表达增强，其中造模后第5d表达值最高，持续时间较长，可达30d。 5.通心络组缺血侧bFGFmRNA表达上调时间点早于神经干细胞大量增殖时间点，bFGF可能为促进Nestin阳性神经干细胞增殖分化的因素之一。 6.bFGF促进Nestin阳性神经干细胞增殖分化，并具有神经保护作用，从而实现通心络对脑缺血再灌注损伤的治疗效果。

目录

文摘

英文文摘

神经干细胞的研究进展

第一部分：通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤后Nestin的影响

第二部分：通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖分化相关细胞因子bFGFmRNA的影响

全文总结

附录：攻读硕士学位期间发表论文

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