杆状病毒基因组扫描技术筛选病毒因子和顺式元件及其表达系统的应用

摘要

本文利用补齐法构建了BmNPV基因组随机文库。将BmNPVDNA用Sau3AⅠ部分酶切，用SalⅠ完全消化质粒载体pUC19，分别以Klenow酶半补齐，连接、转化后得到覆盖率大于99.9％的文库。 通过与文库质粒DNA逐个共转染，鉴定了作用于早期基因helicase启动子的反式激活因子。筛选出的质粒均含有完整的ie-1基因。PCR克隆出ie-1基因共转染即可产生反式激活作用。为证实文库筛选的可靠性，分别克隆了其它主要早期基因并证实产物均不能对helicase启动子产生反式激活作用。瞬时表达分析表明，IE-1还可以对其它不同来源的启动子产生强烈的反式激活。 BmNPVhr3增强子的质粒不能激活另一报告质粒上的luc基因表达，但当细胞受到病毒感染时，便会强烈增强报告基因的表达。利用分别含有hr3的质粒、helicase启动子与luc基因的报告质粒和每个BmNPV随机文库质粒的DNA共转染家蚕细胞，结果显示杆状病毒的必需因子IE-1介导了hr3增强子在Bm细胞中的反式激活作用。进一步研究还证明IE-1因子作为蛋白质桥梁能使增强子对不同来源的启动子发挥广谱性的反式作用。这种增强子的反式作用一般能使转录活性提高40-100多倍。30bp回文序列是hr增强子反式激活中起作用的基本单元。 利用文库共转染筛选时发现一个较小的质粒能反式激活转录几十倍，其不包含任何病毒早期基因，但包含ie-1基因的5’侧翼非编码序列直至起始密码子上游19bp处。瞬时表达证实378bp的ie-1启动子序列能反式增强启动子转录40-100倍，说明此378bpie-1启动子中存在编码某个因子或存在某未知调控方式的一段序列。将此378bpie-1启动子分为不同长度片段以及定点突变证明并非编码因子造成这种反式激活。推测这种转录激活现象是增强序列的反式作用，而介导这种反式作用的蛋白是来源于宿主的细胞因子。将一段238bp序列分别顺式连接于报告质粒的启动子上游或报告基因的下游后发现其可以不分正反，不分上下游并能远距离的增强目的启动子转录10,000倍以上。为了检测此非同源重复区增强子(non-homologousregionenhancer,NHE)对不同启动子的增强活性，将其分别顺式连接至杆状病毒晚期启动子和哺乳动物病毒来源的启动子，发现NHE对它们都能发挥很强的增强作用。另外，通过构建同时含有同源重复和非同源重复这两种类型增强子的报告质粒转染后证实两种类型增强子能够协同作用于报告基因的转录。 通过将杆状病毒转移载体中的polyhedrin启动子替换为ie-1启动子，利用opd为报告基因，再将hr3增强子克隆于opd基因下游构建表达载体。共转染获得包含上述表达盒的重组病毒，通过对表达的OPD活性分析证明，该表达盒具有良好的表达效果。 将pfuDNA聚合酶基因(PfuPol)克隆入转移载体使其处于多角体启动子控制之下。共转染获得重组病毒用于感染家蚕。SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白约90kD，将产物经一步法热变性后即可直接用于高保真PCR中。每毫升血淋巴中PfuDNA聚合酶活性为2×105U。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章基因表达调控中的启动子与增强子元件

第二章研究目的与内容

第三章材料和方法

第四章半补齐法构建BmNPV基因组文库

第五章用BmNPV随机文库筛选杆状病毒因子的研究

第六章IE-1因子介导同源重复区hr3发挥增强子反式激活作用

第七章杆状病毒非同源重复区增强子的发现及其功能鉴定

第八章利用极早期启动子与增强子构建新型杆状病毒表达载体的研究

第九章Pfu DNA聚合酶基因的克隆、表达及其在高保真PCR中的应用

第十章结论

参考文献

致谢

作者简历