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独创性声明及关于论文使用授权的声明
第一章 前言
1.1作物种质资源研究概况
1.2作物种质资源创新研究
1.2.1作物种质资源创新的必要性
1.2.2传统作物种质资源创新的途径
1.2.3基于转基因技术的作物种质资源创新
1.3我国大豆种质资源与遗传改良研究现状
1.3.1我国大豆种质资源研究现状
1.3.2我国大豆遗传改良研究
1.4研究目的与意义
1.5研究的技术路线
第二章材料与方法
2.1植物材料
2.1.1大豆材料
2.1.2水稻材料
2.2主要化学试剂、酶类及试剂盒
2.3培养基、溶液等试剂的配制
2.3.1大豆遗传转化主要组织培养基配方
2.3.2其它试剂及培养基配方
2.4主要实验技术
2.4.1水稻材料胁迫处理
2.4.2植物叶片总RNA的分离与检测
2.4.3 mRNA的分离
2.4.4工程菌液制备
2.4.5基因组DNA的提取
2.4.6 PCR反应
2.4.7 Southern杂交
第三章连接有水稻不同cDNA表达载体的构建
3.1高质量水稻全长cDNA的获得及其末端的改造
3.1.1总RNA的提取与检测
3.1.2 mRNA的分离
3.1.3高质量水稻全长cDNA的合成与质量检测
3.1.4水稻ds cDNA片段大小检测
3.1.5水稻cDNA测序分析
3.1.6水稻ds cDNA末端的补平
3.2载体的筛选与改造
3.2.1质粒载体筛选的原则
3.2.2载体的改造
3.3含不同大小水稻基因表达载体的工程菌构建
3.3.1含不同大小水稻基因表达载体的构建
3.3.2连接产物转化农杆菌
3.3.3农杆菌单克隆菌液PCR检测平末端连接效果
3.3.4含不同大小水稻基因表达载体的工程菌液制备
3.4结果与分析
3.4.1水稻总RNA及mRNA浓度与质量检测结果
3.4.2水稻cDNA的获得
3.4.3插入水稻cDNA片段长度的鉴定
3.4.4部分水稻cDNA序列分析
3.4.5双元表达载体的酶切鉴定
3.4.6平末端连接效果的检测结果
3.4.7 T-A连接效果的检测结果
3.5小结
第四章农杆菌介导大豆快速高效转化体系的构建
4.1传统农杆菌介导大豆转化体系的优化
4.1.1工程菌液制备
4.1.2大豆种子表面消毒
4.1.3大豆种子萌发及不同外植体的获得
4.1.4农杆菌侵染大豆外植体
4.1.5农杆菌与大豆外植体共培养
4.1.6大豆外植体的丛生芽诱导
4.1.7大豆外植体的芽伸长诱导
4.1.8大豆外植体的生根诱导
4.1.9大豆外植体的移栽
4.1.10发芽培养基中6-苄氨基嘌呤的优化
4.1.11诱导培养基中激素浓度的优化
4.1.12其它因子的优化
4.2快速、高效农杆菌介导大豆转化体系的构建
4.2.1工程菌液制备
4.2.2大豆种子表面消毒
4.2.3大豆种子萌发及外植体的获得
4.2.4农杆菌侵染大豆外植体
4.2.5农杆菌与大豆外植体共培养
4.2.6大豆外植体的移栽
4.2.7大豆不同基因型的比较
4.3结果与分析
4.3.1农杆菌介导大豆子叶节和胚尖转化系统的优化
4.3.2快速、高效农杆菌介导大豆转化体系的建立
第五章携带水稻cDNA大豆转基因植株的检测
5.1携带水稻cDNA大豆转基因植株的获得
5.2大豆转基因株系的表型鉴定
5.3大豆转基因株系组织化学GUS基因表达鉴定
5.4大豆转基因株系的分子鉴定
5.4.1转基因植株的PCR检测
5.4.2 RT-PCR检测
5.4.3 Southern检测
5.5结果与分析
5.5.1大豆转化再生植株的表型鉴定
5.5.2大豆转化再生植株的组织化学和分子鉴定
第六章讨论
6.1基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系的建立
6.1.1高质量水稻全长cDNA的获得
6.1.2载体的筛选和改造
6.1.3快速、高效农杆菌介导大豆转基因技术体系的建立
6.2基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系的验证
6.3本研究大豆种质创新技术体系存在的问题
6.3.1 cDNA序列的完整性
6.3.2 cDNA片段分级准确性
6.3.3 cDNA“基因池”的容量
6.4今后研究计划
6.4.1技术体系的完善
6.4.2技术体系的应用
第七章结论
参考文献
附录
致谢
作者简介