鉴别禽流感主要亚型诊断芯片的构建及其应用

摘要

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)亚型众多，变异频繁，现已发现16种不同的血凝素亚型(HA)和9种不同的神经氨酸酶亚型(NA)。根据致病力不同，禽流感可分为高致病性和低致病性，能引起高致病性禽流感发生的主要是H5、H7亚型AIV。目前家禽体内以H5N1、H9N2为主要流行亚型，H7亚型由于其可能造成高致病禽流感的发生也受到严密监控，并且还发现H5，H7和H9亚型逐渐对人有感染性，具有重要的公共卫生学意义。因此建立能迅速、有效的鉴别主要流行亚型禽流感病毒的检测方法对于防制禽流感具有重要意义。 本研究旨在构建并优化可灵敏区分禽流感病毒主要亚型的鉴别诊断基因芯片检测方法，研究内容主要包括： (1)型和亚型特异性探针的制备：根据GenBank上公布的禽流感病毒序列，通过比对分析设计了针对禽流感病毒的M基因，H5、H7、H9亚型HA基因，N1、N2亚型NA基因以及看家基因GAPDH的特异性引物，并成功对目的片段进行了克隆。以重组质粒为模板，用PCR方法扩增制备点样探针。 (2)禽流感亚型诊断芯片的制备和工作条件优化：参照有关文献，将探针及内参基因用点样缓冲液稀释后用芯片点样仪将其点制到醛基化基片上，经过后处理和杂交制备诊断芯片。经过试验摸索确定探针点样浓度为0.5μg/μL，样点中心间距为450μm，样点直径为220μm，点样后室温干燥时间为24h以上，后处理程序为65℃再水合10s、80℃干燥、65mj紫外线交联照射25min，0.1mol/LNaBH4封闭，变性处理为95℃5min。 (3)禽流感亚型诊断芯片的效能评价：在相同条件下，将AIV1-15亚型、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫(NDV)以及SPF鸡胚尿囊液，处理后与芯片杂交、扫描来检测芯片的特异性。将已知EID50病毒尿囊液，测定血凝价，稀释不同滴度，与芯片进行杂交、扫描来检测所制备芯片的敏感度。实验还评价了该诊断芯片的重复性和保存期。特异性试验显示该诊断芯片可以特异性地与目的样品杂交，无交叉反应；敏感性实验中，当RT-PCR的结果已不能给出准确的判断，此诊断基因芯片的杂交信号仍然很强；经过实验评估证明此诊断芯片重复性良好，并且在室温密闭条件下可至少保存2个月而不影响检测效果。 (4)禽流感亚型诊断芯片的现地应用及比较试验：对30份人工感染样品、2l份现地疑似样品进行检测，并同时与鸡胚接种和RT-PCR进行比较以确定该诊断芯片对现地样品检测的应用价值。结果显示感染样品检测中芯片检测方法与鸡胚接种和RT-PCR的符合率分别为100％和96％，现地样品检测呈现100％的符合率，表明该诊断方法可用于现地检测。 通过研究结果表明基因芯片检测方法可以对禽流感做出准确病原学诊断，防止疫情蔓延；单次检验可以准确鉴别禽流感型和主要流行亚型，特异性强，并且敏感性比RT-PCR技术高，具有重复性好，检测快速，准确，高通量等特点，是一种有效的新方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略表

声明

第一章 绪论

1.1引言

1.2禽流感病毒检测技术的研究进展

1.2.1禽流感概述

1.2.2禽流感病毒的检测技术

1.3基因芯片技术及其在病毒研究中的应用

1.3.1基因芯片技术概述

1.3.2基因芯片技术的基本原理

1.3.3基因芯片的制备技术

1.3.4基因芯片样品的使用

1.3.5基因芯片在疾病诊断、预后中的应用

1.3.6基因芯片技术的存在问题及发展前景

1.4本研究的目的和意义

第二章 实验部分

2.1区分禽流感部分亚型诊断基因芯片的实验研究

2.1.1材料与方法

2.1.2结果

2.1.3小结与讨论

2.2区分禽流感亚型诊断芯片的应用研究

2.2.1材料与方法

2.2.2结果

2.2.3小结与讨论

第三章 结论

参考文献

致 谢

作者简历