棉花品种钾营养效率分析和Bt sCry1A基因的构建

摘要

转Bt基因抗虫植物已经在生产上广泛应用。转基因技术的迅猛发展使棉花品种改良技术有了质的飞跃，转Bt抗虫基因棉花被迅速大规模推广的同时，也给农业生产提出了新的难题。 缺钾敏感是Bt抗虫棉品种较突出的一个不足。我国农田严重缺钾，而抗虫棉对钾的需求量较大，利用效率偏低，大部分抗虫棉品种往往因为缺钾引发红叶茎枯病，导致早衰、减产、品质下降等不利结果。因此，要想充分发挥转基因抗虫棉的优势，对其营养特性进行深入研究势在必行。研究表明，运用基因工程技术将钾吸收转运相关基因转入植物是改良植物钾营养效率的一个有效途径。 不同物种和同物种不同品种之间钾的营养吸收利用效率具有显著差异。本文选取了20个生产上广泛应用的棉花品种(系)，通过比较其在适钾和低钾条件下的生长状况，从中筛选到180、343、1779和银优共4个钾高效品种(系)，获得P30、P80、Y18、澳棉、S25等5个钾营养低效品种(系)；确定了苗期初筛耐低钾棉花的参数：钾效率系数与总根长、主茎长、地下部干重、地上部干重4个主要苗期性状的相对指数所构成的综合指数；克隆获得拟南芥高亲和力钾转运基因Atkup1，并构建其植物表达载体，利用花粉管通道法转化棉花。这些工作为发掘影响棉花钾营养效率的关键基因资源，以及进一步改良抗虫棉品种的钾营养效率奠定了基础。 Bt抗虫棉的另一个不足就是生育后期抗虫性下降。研究表明引起抗性下降的主要原因是全长Cry1AmRNA转录本下降，引起活性抗虫蛋白的含量减少所致。本研究通过顺序连接Bt杀虫基因，增加BtCry1A基因的拷贝数，构建出Bt sCry1A表达载体，以期在抗虫棉生育后期延长Cry1AmRNA半衰期，提高活性抗虫蛋白的表达量。将Bt sCry1A基因转化毕赤酵母，87.5％的重组子经试纸条检测有Bt抗虫蛋白的表达，生物杀虫试验表明重组子具有杀虫效果。将Bt sCry1A基因通过农杆菌介导法转入烟草，获得转Bt sCry1A基因的烟草植株12株，转单Bt Cry1A基因的烟草植株3株。杀虫结果表明，在转Bt sCry1A基因的烟草植株中，有33.3％的植株(4/12)表现高抗，58.3％的植株(7/12)表现中抗，8.3％的植株(1/12)不抗虫。3株转单Bt Cry1A基因的烟草中，有1株不抗虫，2株表现中抗。说明BtsCry1A基因表达产物具有强杀虫活性，而且，转Bt sCry1A基因的烟草相比于转单Bt Cry1A基因的烟草，更容易筛选获得高抗虫植株。 20个棉花品种(系)的钾营养效率鉴定研究，不仅为生产应用这些品种提供了钾素营养指导，而且钾营养高效品种的获得还为耐低钾棉花育种提供了宝贵的种质资源，钾营养低效品种的鉴定为借助基因工程方法改良抗虫棉钾营养效率提供了优良的受体材料。两种类型棉花品种的获得也为解析棉花钾营养效率的分子机理奠定了材料基础。同时，Bt sCry1A基因的构建及其功能鉴定，为尝试增加活性结构域，提高抗虫性，延长mRNA半衰期，提高活性蛋白的表达量的研究打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略表

声明

第一章 绪论

1.1我国钾资源状况

1.1.1我国土壤钾素情况

1.1.2我国棉区土壤钾素情况

1.1.3我国钾肥状况

1.1.4钾对棉花的重要性

1.2植物吸钾相关的研究进展

1.2.1植物钾营养效率的差异研究

1.2.2钾吸收基因的认知为棉花钾生理研究的深入提供了契机

1.3 棉花的抗虫研究

1.3.1主要抗虫基因

1.3.2 Bt杀虫蛋白及其基因

1.3.3 Bt杀虫蛋白的抗虫机理

1.3.4转Bt基因抗虫植物的研究概况

1.3.5转基因抗虫棉存在的问题

1.4展望

1.5本研究的目的、意义及研究方案

1.5.1本研究的目的、意义

1.5.2研究方案

第二章 棉花品种(系)的钾营养效率分析

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2试验方法

2.2结果与分析

2.2.1钾对不同棉花品种的影响

2.2.2钾对不同棉花品种钾效率和钾含量的影响

2.3小结

第三章 KUP基因克隆与植物表达载体构建

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1拟南芥总RNA的获得

3.2.2 Atkup1基因的扩增

3.2.3 Atkup1全长基因的获得

3.2.4植物表达载体的构建

3.2.5花粉管通道法转化棉花

3.3小结

第四章 Bt sCry1A基因的构建及在毕赤酵母中的表达

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1酵母表达载体的构建

4.2.2重组载体转化毕赤酵母及重组酵母的筛选

4.2.3酵母重组子的PCR检测

4.2.4分泌型转化子的筛选

4.2.5 Bt sCry1A蛋白的SDS-PAGE分析

4.3小结

第五章 Bt sCry1A基因在烟草中的表达

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1质粒载体的构建及其鉴定

5.2.2植物表达载体导入农杆菌的PCR鉴定

5.2.3烟草外植体的转化及再生植株的获得

5.2.4再生植株的PCR检测

5.2.5杀虫活性分析

5.3小结

第六章 全文讨论、结论与创新点

6.1讨论

6.1.1吸钾相关基因的研究

6.1.2耐低钾棉花品种的筛选

6.1.3转基因抗虫棉生育后期抗性减弱问题

6.2结论

6.3本研究的创新点

参考文献

致谢

作者简历