Functional Analysis of GhNAC18 and GhNAC20 during Leaf Senescence and Stress Responses in Cotton(Gossypium hirsutum L.)

摘要

叶片衰老是一个复杂的发育阶段，既涉及到退化又有养分循环过程。这个阶段的特点是叶绿素含量降低，蛋白质、核酸、油脂降解以及养分的运转。叶片衰老的发生和进展由一系列环境因素（例如干旱、黑暗、极端温度和病原体攻击）及内源因子（包括年龄、乙烯、茉莉酸、水杨酸、脱落酸和细胞分裂素）控制。如果叶片提前衰老，作物尤其是棉花的产量和品质会受到不良影响。虽然已报道多个基因调控叶片衰老，但还有许多转录因子的功能未阐明。NAC(NAM, ATAF1,2和 CUC2)是最大的植物特有的转录因子之一，在植物的发育和应激反应中起多种作用，包括叶片衰老、花器官形态建成、侧根发生、顶端分省组织发育、分枝发育和激素信号途径。NAC家族基因都有一个结构域，这个结构域与植物的非生物胁迫和生物胁迫响应有关，如盐胁迫、冷休克、干旱、机械损伤和病毒感染。植物中 NAC家族基因在拟南芥和水稻中研究较为透彻。在棉花中也报道了一些但还有许多在植物发育和应激反应中起多种作用的基因未被发掘。
　　本研究中克隆了棉花中与叶片衰老和应激反应有关的GhNAC基因。GhNAC18和GhNAC20的cDNA全长分别为1511bp和1090bp。GhNAC18编码一个含419个氨基酸的蛋白质，GhNAC20编码一个含281个氨基酸的蛋白质。使用WoLF PSORT预测两个蛋白质均定位于细胞核，证实了它们是核转录因子。正如许多其它 NAC家族的转录因子，这两个基因都有三个外显子和两个内含子。前两个外显子编码氨基端的结构域，最后一个外显子编码高度不同的羧基端区域，这可能是它们功能不同的原因。转录激活作用发生在羧基端区域。
　　组织特异性表达分析表明这两个基因在所有的组织中都有表达，但在不同的器官中表达不同。例如虽然两个基因在子叶和幼叶中表达量都很高，但在衰老的叶片中表达不同。GhNAC20在衰老的叶片中表达量较高而GhNAC18只在幼叶和子叶中表达量较高。这表明它们在叶片衰老中可能是拮抗的，GhNAC20促进衰老，GhNAC18抑制衰老。
　　使用四种激素处理植株，脱落酸（ABA）、茉莉酸（MeJA）、水杨酸（SA）及乙烯（ET），分析两种基因的表达表明二者都会响应这四种外源激素，但诱导时间和强度不同。ABA可使GhNAC20上调表达，GhNAC18下调表达。ET可使两个基因的表达量升高，GhNAC18在处理后的6h表达量达到高峰而GhNAC20在处理后的36h表达量达到最高。GhNAC20可被MeJA强烈诱导且在处理后36h表达量达到最高，GhNAC18的表达量则无明显变化。SA处理下GhNAC20的表达量显著高于GhNAC18。盐分诱导GhNAC20表达但却抑制GhNAC18的表达。两个基因都在2h时响应H2O2。机械损伤上调GhNAC20且在处理后2h达到高峰，GhNAC18则在处理后8h表达量最高。
　　为了确认它们在叶片衰老中的作用，测量了自然衰老和黑暗诱导衰老条件下二者的转录水平。在这两种类型的衰老中GhNAC20显著上调，GhNAC18表达量显著降低。使用VIGS技术敲减GhNAC20基因，GhNAC20沉默的植株叶片衰老延迟。在拟南芥中过表达GhNAC18，T2代转基因株系表现出延迟衰老的表型。这些结果表明 GhNAC20是叶片衰老的正调控因子而GhNAC18起抑制作用，且两者都参与了棉花的应激反应。

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ABBREVIATION

DEDICATION

CHAPTER ONE INTRODUCTION

1.1. Cotton

1.2. Leaf senescence

1.3. Environmental Factors Influencing Leaf Senescence

1.4. Involvement of Phytohormones in Leaf Senescence

1.5. NAC family and leaf senescence

1.6. Gene Cloning

1.7. Agrobacterium-mediated transformation

1.8. Virus-Induced gene silencing \(VIGS\)

1.9. Research Objective

CHAPTER TWO MATERIALS AND METHODS

2.1. Plant materials, growth conditions and stress assays

2.2. Total RNA isolation and cDNA synthesis

2.3. Cloning of GhNAC18 and GhNAC20 genes

2.4. Multiple Sequence Alignment and Phylogenetic Analysis

2.5. Bioinformatics analysis

2.6. Transcriptional activation activity of GhNAC18 and GhNAC20

2.7. Promoter Analysis

2.8. Quantitative RT-PCR assays

2.9. Construction of GhNAC18 plasmid and Arabidopsis transformation.

2.10. Plasmid construction for VIGS Assay and vector inoculation

2.11. Measurement of chlorophyll content

2.12. Experimental design and statistical analysis

CHAPTER THREE 3. RESULTS

3.1. Characterization and bioinformatics

3.2. Sequence analysis of GhNAC proteins.

3.3. Promoter analysis

3.4. Expression analysis of GhNAC18 and GhANC20 in different organs.

3.5. Phytohormone analysis on GhNAC18 and GhNAC20.

3.6. Expression of GhNAC18 and GhNAC20 under abiotic stress.

3.7. Transcriptional activation activity

3.8. Expression of the two genes during leaf senescence

3.9. Knockdown of GhNAC20 by VIGS delays leaf senescence in cotton

3.10. Overepresion of GhNAC18 in Arabidopsis

CHAPTER FOUR DISCUSSION

CONLUSION

参考文献

SUPPLEMENTARY INFORMATION

致谢

RESUME