甘蓝类蔬菜抗根肿病基因定位、克隆及抗感材料比较转录组分析

摘要

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassieae Woron.）侵染引起的一种土传病害，严重威胁着青花菜及其他十字花科蔬菜的生产，培育抗病品种是防治根肿病最有效的方法。本研究针对根肿病抗源筛选、抗病基因定位和克隆及抗病机理研究等方面开展了一系列工作，主要结果如下:
　　1.以根肿菌四号小种为接种物，对176份甘蓝类材料进行了抗病性鉴定，初步获得6份高抗(HR)材料，48份抗病(R)材料，这些材料有待于进行重复鉴定。对以抗根肿病甘蓝先甘336及花椰菜托尼为母本与青花菜及甘蓝杂交获得的F1代进行了抗病性鉴定，大多数F1代的病情指数比父本降低，但也有部分F1抗病性明显增强。
　　2.分别以甘蓝基因组02-12及TO1000DH为参考对甘蓝近缘野生种B2013，青花菜自交系90196进行重测序分析，找出2个亲本之间的多态性SNP及InDel变异，纯合的InDel用于标记开发，共设计了2万多对InDel引物，81.78％可以在双亲间扩增出差异条带。
　　3.抗病亲本B2013和感病亲本90196表型稳定，F1病情指数介于双亲之间且偏向予抗病父本，两个亲本构建的分离群体中所有单株抗病级别的分布呈连续性，说明抗病性状是一个多基因控制的数量性状，且存在显性的主效基因。
　　4.通过QTL-seq结合生物信息学分析发现在甘蓝9号染色体上32.01-40.01Mb之间出现了SNP-index不平衡的现象，同时此区域的△(SNP-index)在99％的置信水平下大于阈值，说明该区域可能是控制甘蓝根肿病抗性的一个QTL位点，记为BoCR9.1。传统遗传连锁分析方法验证了9号染色体上的这个QTL位点，并将BoCR9.1缩小至9号染色体上38.79Mb到39.35之间的560Kb内。
　　5.根据甘蓝参考基因组02-12注释信息，在BoCR9.1的560Kb区间内共有108个基因，结合QTL-seq预测结果，发现基因Bol044005存在非同义SNP位点且与抗病相关，该基因编码TIR-NBS-LRR(TNL)类蛋白，推测为BoCR9.1的一个候选基因。根据Bol044005的序列信息设计引物，通过分段扩增和克隆测序拼接获得了cDNA的全长序列，发现其编码区在抗感亲本间有26个SNP，造成14个氨基酸突变，这些变异位于Bol044005蛋白TIR与LRR结构域。
　　6.通过显微观察，发现抗感病亲本的根毛侵染期及皮层侵染期均出现在7DAI与14DAI，选取3个时期取样(0DAI、7DAI、14DAI)进行转录组测序。结果显示，寄主对根肿菌的防御反应在早期被诱导且相关途径在T14时期受到抑制，与细胞壁成分、硫甙葡萄糖苷合成及植物信号转导相关的基因均在侵染早期表达。双亲间存在较多DEGs包括NBS-LRR、SA代谢相关、细胞壁重塑、几丁质酶等基因，这些基因的差异表达可能是造成抗感亲本呈现不同抗病性的原因。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．2 野生甘蓝的研究

1．2．1 野生甘蓝分类及起源

1．2．2 野生甘蓝与栽培甘蓝的关系

1．2．3 野生甘蓝的应用

1．3 高通量测序技术与数量性状定位

1．3．1 Extreme QTLmapping(X-QTL)

1．3．2 MuOllaD

1．3．3 QTL-seq

1．4 根肿病抗性基因研究

1．4．1 白菜CR基因研究

1．4．2 甘蓝CR基因研究

1．4．3 甘蓝型油菜CR基因研究

1．5 抗根肿病机理研究

1．6 本研究的目的与意义

第二章 甘蓝类蔬菜作物根肿病抗源筛选及抗性评价

2．1 材料及方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果

2．2．1 先甘336／托尼×甘蓝／青花菜根肿病抗性鉴定

2．2．2 甘蓝类材料根肿病抗性评价

2．3 讨论

第三章 青花菜与甘蓝近缘野生种材料重测序分析及InDel标记开发

3．1 材料及方法

3．1．1 测序材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果

3．2．1 全基因组重测序

3．2．2 测序数据与参考基因组比对

3．2．3 变异检测与注释

3．2．4 系统进化树构建

3．2．5 双亲间多态性InDel标记开发

3．3 讨论

3．3．1 甘蓝参考基因组

3．3．2 甘蓝全基因组重测序

3．3．3 基于重测序数据的InDel标记开发利用

第四章 抗根肿病基因定位及候选基因分析

4．1 材料及方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果

4．2．1 抗性遗传分析

4．2．2 QTL-seq预测控制抗根肿病性状的候选区域

4．2．3 遗传连锁分析缩小定位区间

4．2．4 候选基因预测

4．2．5 候选基因序列分析

4．3 讨论

第五章 青花菜及甘蓝近缘野生种在不同侵染时期对根肿菌响应的比较转录组分析

5．1．2 试验方法

5．2 结果

5．2．2 RNA测序及De nOVO组装

5．2．3 qRT-PCR验证

5．2．4 差异基因表达分析、聚类及功能富集

5．2．5 T7时期DEGs功能注释

5．2．6 T14时期DEGs功能注释

5．2．7 B2013和90196之间与抗性相关的DEGs

5．3 讨论

5．3．1 不同类型抗性根肿菌侵染过程不同

5．3．2 细胞骨架成分与DNA修复在寄主被根肿菌侵染早期起作用

5．3．3 宿主对根肿菌的防御反应在早期被诱导且相关途径在T14时期受到抑制

5．3．4 根肿菌响应相关的DEGs导致不同基因型发病症状差异

第六章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历