ORFV与CBP蛋白引起鼠源DCs的免疫应答效应及转录水平的差异分析

摘要

羊传染性脓疱病毒(Contagious Ecthyma virus of sheep)亦称羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)能引起山羊和绵羊急性、接触性皮肤传染性疾病，患病羊主要表现在唇部、口腔黏膜形成红斑、丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂。感染ORFV后机体能产生强烈的免疫应答反应，并且ORFV可以编码大量的免疫调节蛋白用于宿主免疫或炎症反应通路实现对宿主的免疫调节作用。趋化因子结合蛋白(Chemokine binding protein，CBP)是ORFV在感染早期表达的一种重要的毒力蛋白，在调控宿主免疫应答方面发挥重要的作用。DC作为体内唯一一个能够直接刺激初始T细胞活化增殖的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，在免疫调节和介导外周性免疫耐受中发挥重要的免疫应答作用。目前关于体外条件下ORFV及其毒力蛋白CBP作用于小鼠骨髓源DC的研究甚少。因此，本实验通过表达纯化原核蛋白CBP;通过表面标志物、细胞因子等试验检测ORFV及蛋白CBP是否促进DCs细胞的分化和成熟;最后对ORFV及CBP作用前、后引起DCs的差异基因进行分析验证。本试验为研究ORFV与宿主免疫细胞的相互作用提供理论依据，为进一步阐释ORFV感染宿主的免疫调节机制奠定基础。取得的结论如下: 1、构建了pET-28a(+)-ORFV112原核表达载体，成功表达纯化了该蛋白; 2、成功制备了纯度较高的DCs，不同浓度的羊口疮病毒均能够极显著的促进DCs表面共刺激分子CD86、CD40的表达，显著增加IL-1β、IL-6、IL-12以及TNF-α等细胞因子的分泌量;100ng CBP蛋白作用DCs后共刺激分子和细胞因子均显著增加，与病毒作用DC后所产生的效果相类似。另外羊口疮病毒及100ng CBP蛋白均能够促进小鼠DC的成熟并诱导T细胞向Th1方向分化，以及促进T细胞释放IFN-γ细胞因子来增加机体对外来病原体的杀伤作用。 3、采用RNA-seq测序技术对ORFV和CBP蛋白作用后的DC的基因表达水平进行检测，结果表明ORFV刺激DCs组与未刺激组相比，共有8241个差异基因，上调基因4205个，下调基因4036个;CBP刺激DC后与未刺激的细胞相比，共有7301个差异基因，上调基因3535个，下调基因3766个。差异基因分析结果显示，共同变化的差异基因主要集中于细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、抗原递呈与加工过程、T细胞受体信号通路以及细胞周期和凋亡等途径中。 4、RT-PCR结果显示共同差异基因CD8B、Ctse、IL2RA、Atp5e、CD80、Lck、CCL8与DC组相比，均为显著上调，基因Cstb、Akt、CCR1与DC组相比，均为显著下调，与RNA-seq测序结果一致。