我国欧洲型PRRSV的流行病学调查与单克隆抗体的制备

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的母猪流产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪呼吸障碍症状的疾病。PRRSV可分为2个基因型，分别是以欧洲Lelystad virus毒株为代表的欧洲型(基因1型)和以美洲VR-2332为代表的美洲型(基因2型)。目前，国内有关欧洲型PRRSV流行病学研究较少，为了了解欧洲型PRRSV在中国的流行情况，加强对欧洲型PRRSV的监测十分重要。 2016～2018年，本研究从全国350份疑似PRRSV感染的病料中检测到5株欧洲型PRRSV，并命名为ZD1株、WK14株、WK141株、WG9株和HN7株。对这5株病毒进行了全基因组序列分析及遗传演化分析。核苷酸比对结果显示，与美洲型参考株VR2332的全基因组核苷酸同源性为60.0％～60.4％，与欧洲型参考株Lelystad virus毒株核苷酸同源性为88.3％～88.9％。ZD1、WG9、HN7株与LNEU12株的核苷酸同源性最高分别为93.5％、93.3％、93.2％，WK14株与BJEU06-1核苷酸同源性最高为89.7％，WK141与NVDC-NM3核苷酸同源性最高为93.5％。Nsp2、ORF3和ORF4推导aa序列比对结果表明，本研究中ZD1株的ORF3提前26个aa终止，另外WK14、WK141、WG9和HN7株在ORF3的246位存在1个aa的缺失;WK14、WK141、WG9、HN7和ZD1株PRRSV在ORF4的66位皆存在1个aa的缺失;此外，这5株欧洲型PRRSV在Nsp2的357～360和411位分别存在4+1个aa的缺失。这种缺失或提前终止增加了欧洲型PRRSV的变异程度，然而这种变化对PRRSV生物学特性的影响尚不清楚。重组是造成PRRSV变异的主要原因之一，关于美洲型PRRSV发生重组的报道屡见不鲜，但目前为止关于欧洲型PRRSV重组现象的报道较少。重组分析表明，本研究分离的5株欧洲型PRRSV中，WK14是BJEU06-1和NVDC-FJ的重组病毒，重组区域位于第951～3251位碱基处;WK141是NVDC-NM1-2011和HENZMD-10的重组病毒，重组区域位于7131～9111位碱基处。这种重组现象在欧洲型PRRSV中出现较少的原因比较复杂，推测可能与这类病毒株的特性有关。 目前国内针对PRRSV抗体检测方法大多是针对N蛋白，但是欧洲型和美洲型PRRSV N蛋白血清抗体有交叉反应，无法通过检测抗体来判断欧洲型PRRSV在中国的流行情况，因此建立针对欧洲型PRRSV特异性抗体检测方法有十分重要的意义。本研究以超离纯化的PRRSV ZD1全病毒作为免疫原免疫小鼠，成功制备2株杂交瘤细胞株2C5和2C6。亚型鉴定表明，杂交瘤细胞2C5和2C6分泌的单克隆抗体重链均属于IgG2a亚类，轻链为kappa链。杂交瘤细胞2C5和2C6培养上清和制备的腹水中抗体的IFA效价分别为1∶320，1∶16000和1∶320，1∶8000。IFA试验表明2C5和2C6能区分欧洲型和美洲型PRRSV，说明2C5和2C6具有较好的特异性。用纯化的DV全病毒作为包被抗原，单克隆抗体2C5和2C6与病毒的结合可以被猪欧洲型PRRSV阳性血清阻断。本研究制备的2C5和2C6单克隆抗体为建立特异性检测欧洲型PRRSV抗体方法提供了基础。