α-乳白蛋白源DPP-4抑制肽的制备以及结构解析与功能评价

摘要

糖尿病是全球三大流行病之一，其中二型糖尿病(T2DM)占90％以上。近些年来，具有比化学合成类药物更多优势的食品源降糖物质被开发出来并得以应用，如谷类蛋白，鱼肉蛋白及乳蛋白。据文献报道，α乳白蛋白作为DPP-4抑制肽的来源具有较高的潜力。因此，本文以商品化的α-乳白蛋白为原料，利用中心组合-响应面实验(CCD-RSM)水解样品，经过分离纯化，鉴定与合成，得到DPP-4活性肽序列，进行体外抑制活性及功能的化学验证及模型细胞验证。主要结论如下: 1、α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)是Ⅱ型糖尿病的治疗中两种重要的靶向酶。市售的商品化酶来源主要为微生物源，与哺乳动物来源的酶的性质有一定的差异，难以客观的评价这两种酶的抑制剂的筛选。本研究收集新鲜的猪小肠黏膜分泌物及上皮细胞，以现有商业化酶做对照，分析不同部位猪小肠黏膜提取物的α-葡萄糖苷酶和DPP-4酶活及比活力，确定合适的稀释倍数及有效部位，建立了猪小肠源α-葡萄糖苷酶和DPP-4的酶活测定体系，为本研究α-葡萄糖苷酶和DPP-4抑制剂的体外筛选提供可靠的测定方法体系及低廉的酶来源。 2、为了更有效的获得来源于α乳白蛋白源的DPP-4抑制活性肽，设计单因素实验获得四个因素的中心点，在此基础上，利用中心组合实验(CCD)对获得的30组响应值依次测定DPP-4抑制活性，此后进行响应面分析，进行二次非线性回归拟合，回归模型具有高度显著性(P＜0.0001)。这表明该模型可用于筛选水解条件。根据此模型预测的最佳酶解条件:酶解温度41.5℃、酶解时间129min、胰蛋白酶量4537U/g pro、α乳白蛋白浓度:7％。 3、为了进一步甄别α乳白蛋白酶水解物中具有DPP-4抑制活性的肽，本研究采用膜分离串联蛋白分离纯化系统对酶的水解物进行分离纯化，使用LC-MS/MS进行序列鉴定，根据序列评分，获得来源于α乳白蛋白的六组肽序列。同时采用化学固相合成这六组肽，对这六组肽进行体外抑制活性验证。结果表明活性肽LDQWLCEKL的活性最高，DPP-4半数抑制浓度(IC50)达到131.07μm。此外还使用Lineweaver-Buck双倒数法分析了活性肽的抑制类型，证明LDQWLCEKL的抑制类型为非竞争性抑制。 4、以NCI-H716细胞为模式细胞，分别以不同浓度的合成肽与细胞作用不同时间，分别测定细胞内、外DPP-4的相对活性及GLP-1的含量。阳性药LGT能够有效抑制DPP-4及GLP-1的表达及相对活性，并体现出了良好的浓度和时间依赖性。活性肽的效果不尽相同，LDQ能够降低细胞内DPP-4的相对活性，但其他四组活性肽的抑DPP-4效果并不明显;GLP-1方面，活性肽LDQ能够促进GLP-1的分泌和表达，而活性肽ILD无法促进GLP-1的表达和分泌。