小麦黄花叶病毒致病性分化及CI基因序列分析与原核表达

摘要

利用小麦黄花叶病毒(WYMV)提纯病毒作为抗原,免疫豚鼠制备特异性的WYMV豚鼠抗血清,采用微量沉淀法及免疫双扩散测定其效价为2<'7>.建立了以豚鼠抗血清为诱捕抗体、以兔抗血清为检测抗体的异种动物双抗夹心法检测WYMV的实验方法.选择有代表性的小麦品种或育种材料26份,并从日本和美国收集到用于区分株系材料6份,在河南潢川、湖北罗田、四川雅安、江苏扬州四地进行致病性分化田间试验,根据品种的反应,并结合ELISA、RT-PCR、Western-blotting等方法进行致病性分化检测.通过RT-PCR,获得了WYMV湖北罗田分离物细胞质内含体蛋白(CI,cylindrical inclusion protein gene)基因的cDNA克隆.将含有WYMV CI基因的重组质粒经NdeI和EcoRI酶切、克隆到pET-28a(+)上,构建了原核表达载体pETCIb,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后表达出37kDa蛋白.纯化表达产物后,免疫家兔制备抗血清.经SDS-PAGE和Western-blotting分析,获得了WYMV CI蛋白的专化性抗血清.

目录

Abstract

缩略词

第一部分文献综述

1小麦黄花叶病毒研究进展

1.1分布、症状、危害和防治

1.2病毒的传播介体--禾谷多粘菌(Polymyxagraminis)

1.3 WYMV病毒的特性

1.4 WYMV RNA基因结构与功能

1.5致病性分化研究

2本课题的研究目的和意义

第二部分异种动物抗血清在小麦黄色花叶病毒检测中的应用

1材料和方法

1.1实验材料

1.2 WYMV病毒的提纯

1.3抗血清的制备及浓度的测定

1.4 Western检测

1.5 ELISA缓冲液的配制

1.6间接ELISA

1.7异种动物双抗夹心ELISA

1.8田间病样的检测

2结果

2.1WYMV豚鼠抗血清的制备

2.2 Western检测

2.3异种动物双抗夹心ELISA最适条件的确定

2.4异种动物双抗夹心ELISA灵敏度的测定

2.5田间病样的检测

3讨论

第三部分小麦黄色花叶病毒致病性分化的测定

1实验材料

1.1小麦品种

1.2酶和试剂

1.3引物序列

2方法

2.1小麦样品总RNA的提取

2.2致病性田间测定实验设计

2.3小麦黄色花叶病害的田间调查

2.4 ELISA检测病毒

2.5 RT-PCR方法检测病毒

2.6 Western检测

3.结果与讨论

3.1结果

3.2讨论

第四部分小麦黄花叶病毒湖北分离物CI基因的克隆及序列分析

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

3讨论

第五部分WYMV细胞质内含体原核表达载体的构建、表达及抗血清制备

1材料

1.1菌株和质粒

1.2酶和试剂

1.3引物序列

2.方法

2.1基本的分子生物学方法

2.2 WYMV CI基因原核表达载体的构建、诱导表达及专化性抗血清的制备

2.3序列测定和分析

3结果与分析

3.1原核表达载体的构建

3.2序列分析

3.3原核表达

3.4抗血清的制备

4讨论

小结

参考文献

致谢