不同种属动物肝微粒体CYP450酶对钩吻代谢的影响

摘要

目的:中药钩吻是世界著名的有毒植物，历代本草著作对其都有收载，其使用历史源远流长，具有祛风攻毒、散结、止痛的功效。现代研究表明钩吻的根、茎、叶均有剧毒，为了更有效和安全的利用钩吻总生物碱，我们开展了半数致死量的研究。钩吻素子作为钩吻植株中含量最高的生物碱，选择其做为研究对象，进行猪、羊和小鼠肝脏微粒体对其代谢表征的比较研究，可以初步揭示其肝脏解毒的部分机制所在。由于发现猪羊与小鼠对钩吻的代谢存在不同之处，故运用细胞色素P450酶活性的异同来初步揭示三者之间的机制的异同。方法本课题首先将闽产钩吻根粉碎后用95％乙醇提取，减压下回收乙醇，加2％盐酸溶解后用氯仿萃取，浓氨水碱化水层，再用氯仿萃取，得到钩吻根总生物碱。根据预试验结果将40只小鼠分成4组，每组10只，按照5.5 mg/kg、4.4 mg/kg、3.52 mg/kg、2.82 mg/kg的剂量一次性灌服小鼠后观察24 h内的情况。通过记录小鼠临床症状及死亡情况，观察闽产钩吻根总生物碱的急性毒性并用孙氏改良寇氏法计算LD50及其95％的可信区间。同时本课题采用Bradford法蛋白质定量测定试剂盒方法和Omura法对小鼠、猪以及羊肝微粒体的蛋白质及CYP450含量进行了测定，并运用高效液相色谱法，色谱柱:依利特色谱柱，150 mm×4.6 mm，i.d.5.0μm;流动相:乙腈:0.1％三乙胺，体积比为20∶80;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;紫外检测波长:254 nm;进样体积:20μL，来检测猪、羊和小鼠肝脏微粒体对其代谢表征的不同，我们运用探针法考察猪、羊、小鼠以及经过钩吻诱导后细胞色素P450酶活性的异同从而来初步揭示三者之间的机制的异同。结果经过实验研究发现闽产钩吻根总碱经口服给药对小鼠的LD50为4.12 mg/kg，其95％的可信区间为3.76～4.52 mg/kg。检测出所制备的小鼠、猪、羊肝微粒体的蛋白含量为6.973 mg/mL、24.805 mg/mL、28.200 mg/mL，CYP450的含量分别为0.379 nmol/mg、0.798 nmol/mg、0.847 nmol/mg。通过高效液相色谱法发现猪羊对钩吻素子均有代谢而小鼠未有明显代谢，同时我们对猪羊肝微粒体对钩吻素子代谢的最优条件进行了考察，研究发现钩吻素子在猪肝微粒体中代谢的最优体外反应体系条件是:孵育时间为90 min、肝微粒体蛋白浓度为2.5 mg/mL、钩吻素子的浓度500μg/mL;钩吻素子在羊肝微粒体中代谢的最优体外反应体系条件是:孵育时间为70 min、肝微粒体蛋白浓度为3.0 mg/mL、钩吻素子的浓度500μg/mL。通过探针药物法，最终通过实验推测CYP2A6酶与钩吻总碱的代谢（降解、包裹等）具有较大相关性。结论运用探针法考察猪、羊、小鼠以及经过钩吻诱导后细胞色素P450酶活性的异同从而来初步揭示三者之间的机制的异同，最终通过实验推测CYP2A6酶与钩吻总碱的代谢（降解、包裹等）具有较大相关性。

目录

声明

摘要

前言

第一章 闽产钩吻总生物碱半数致死量实验研究

1 实验材料

1．1 试药

1．2 仪器

1．3 动物

2 实验方法

2．1 钩吻根总生物碱制备

2．2 溶液配制

2．3 急性毒性试验预试验

2．4 急性毒性实验正式试验

3 实验结果

4 讨论

第二章 正常小鼠、猪和羊肝微粒体制备及蛋白含量测定

1 实验材料

1．1 试剂

1．2 仪器

1．3 实验动物

2 实验方法

2．1 溶液配制

2．2 肝微粒体制备

2．3 肝微粒体蛋白含量测定

2．4 肝微粒体CYP450含量测定

3 实验结果

3．1 牛清血蛋白标准曲线

3．2 肝微粒体基本参数

4 讨论

第三章 不同种属动物肝微粒体对钩吻素子的代谢比较研究

1 实验材料

1．1 试药

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 溶液配制

2．2 色谱条件

2．3 钩吻素子的体外温孵实验和样品前处理

2．4 体外反应体系的条件优化

3 实验结果

3．1 不同种属动物肝微粒体对钩吻素子的代谢比较

3．2 猪肝微粒体孵育体系体外反应的最优条件

3．3 羊肝微粒体孵育体系体外反应的最优条件

4 讨论

第四章 不同种属动物CYP450酶活性大小与钩吻代谢的相关性研究

1 实验材料

1．1 试药

1．2 仪器

1．3 实验动物

2 实验方法

2．1 溶液配制

2．2 动物预处理

2．3 肝微粒体混合酶系组成

2．4 色谱条件

2．5 CYP450同工酶活性测定方法

2．6 探针药物标准曲线制备

3 实验结果

3．1 探针药物标准曲线

3．2 不同种属动物CYP450酶活性测定液相色谱图

3．3 不同属动物CYP450酶活性大小

4 讨论

总结

参考文献

致谢

综述

作者简历