Clostridium autoethanogenum转氢酶Nfn的性质和功能研究

摘要

Clostridium autoethanogenum既可以果糖和木糖异养生长,也可以固定二氧化碳、氢气和一氧化碳进行自养生长,生成乙醇和乙酸等产物,在环境碳循环和生物能源方面倍受关注,已被用来发酵生物质合成气或石油精炼和钢铁冶炼等工业废气生产乙醇.C.autoethanogenum固定二氧化碳和一氧化碳是经Wood-Ljungdahl途径进行的,但该过程的生理代谢机理尚不完全清楚.调查粗酶液发现它含有很高的铁氧还蛋白依赖的转氢酶Nfn的活性(0.7U/mg).对其基因组分析发现,C.autoethanogenum含有一个特殊基因,其编码的蛋白与来自克氏梭菌的铁氧还蛋白依赖的转氢酶NfnAB具有很高的相似性,其N端与NfnA具有相同结构域,具有结合FAD、2[4Fe4S]型铁硫簇和NAD的位点,而C端与NfnB具有相同的结构域,具有结合FAD、[2Fe2S]型铁硫簇和NADP的位点,推测在C.autoethanogenum中该蛋白是NfnA和NfnB的天然融合蛋白.进一步将该基因在大肠杆菌中进行异源表达,纯化后电泳显示该蛋白为约85kDa的单带;紫外扫描发现该蛋白具有典型的黄素和铁硫簇的吸收峰;酶活力测定显示,该酶呈现出与克氏梭菌NfnAB一样的活力,其NAD依赖的NADPH还原铁氧还蛋白的活力达到4.2U/mg.这些结果表明该酶在C.autoethanogenum中起着与克氏梭菌NfnAB相同的功能,结合该菌固定二氧化碳的Wood-Ljungdahl途径,判断该融合蛋白在胞内利用NADH和铁氧还蛋白催化还原NADP,为途径中NADP依赖的亚甲基四氢叶酸脱氢酶提供NADPH,在胞内起到维持氧化还原平衡和节能的作用.进一步对公共数据库中的微生物基因组分析显示,许多环境微生物都含有该酶的编码基因,包括产乙酸菌如Moorrella thermoacetica、产甲烷古菌如Methanosarcina barkeri、脱硫菌如Desulfomicrobium baculatum、脱卤菌如Dehalococcoides ethenogenes和金属铀还原地杆菌Geobacter uraniumreducens等,表明该酶在自然界广泛分布,在环境微生物的代谢中具有重要作用.