PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用

摘要

目的:评估PKH26标记技术结合活体成像系统在组织工程椎间盘中应用的可行性.rn 方法:从山羊椎间盘中分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置显微镜下观察,传代获取P1代髓核细胞,按照说明书对P1代髓核细胞进行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并进行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色,台盼蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖基因表达,将标记后的细胞接种入一体化椎间盘支架的髓核部分,纤维环部分作为对照,体外培养3d后将其植入裸鼠体内,培养6w后活体成像技术检测细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围.rn 结果:倒置显微镜下P1代细胞呈类软骨样细胞形态，P1代髓核细胞甲苯胺蓝染色异染和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性;标记荧光强度均匀，PKH26标记前后细胞活性均在95%以上，标记前后细胞生长曲线无明显差异，差异无统计学意义(P＞0.05)，实时荧光定量PCR表明标记前后细胞细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖基因表达无明显差异，差异无统计学意义(P＞0.05)，活体成像技术显示体内髓核支架有强烈的荧光，纤维环支架未见荧光。rn 结论:PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖、及细胞表型的表达无明显影响，结合体外成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。