兔气管软骨细胞的分离培养及生物学特性研究

摘要

目的:建立一种简单、可行的兔气管软骨细胞体外分离培养的方法,并从细胞形态、超微结构、基因表达和蛋白合成等方面明确气管软骨细胞生物学特性,为组织工程气管移植治疗气管狭窄提供种子细胞.方法:通过酶消化法分离气管软骨细胞并传代培养至第一代.倒置显微镜观察软骨细胞形态;电镜观察软骨细胞超微结构;荧光实时定量quantitative real time-PCR(qRT-PCR)、免疫细胞化学染色和甲苯胺蓝染色分别检测软骨细胞特征性细胞外基质成分mRNA基因的表达和蛋白合成水平.结果:倒置显微镜下见原代气管软骨细胞培养24h后呈短小三角形或不规则形贴壁生长，培养第6天细胞聚集形成明显集落，增殖速度加快，约7-10天细胞融合达90%以上;传代的细胞约4-5小时贴壁，3-5天己融合达90%以上，呈鱼群样聚集生长。电镜结果显示细胞表面孔隙较多，有伪足，胞质丰富，细胞器发达，可见蛋白分泌物。qRT-PCR显示软骨细胞表达Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等特征性细胞外基质成分的mRNA基因(P＜0.05)。免疫细胞化学染色示培养的软骨细胞表达Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、转录因子SOX9;甲苯胺蓝染色显示软骨细胞核染成深蓝色，胞质染成蓝紫色。结论:适宜的酶消化法容易获得兔气管软骨细胞，且具有良好的分泌软骨细胞特征性细胞外基质成分的特性，可作为组织工程气管移植的种子细胞。