壳聚糖纳米粒基因载体的制备及其转染研究

摘要

目的：制备载基因壳聚糖纳米粒,研究纳米粒的结构特征以及其在体外和体内实验中的转染能力。 方法：用表达绿色荧光蛋白的质粒作报告基因,采用复凝聚法制备壳聚糖/pEGFP-C1纳米粒。通过激光粒度测定仪和原子力显微镜对纳米粒的形态和粒径分布送行考察；应用凝胶阻滞和DNA酶消化实验检测CS对质粒基因的结合、保护作用；用体外和体内基因转染实验,评价纳米颗粒的转染能力；使用共聚焦显微镜对黑色素瘤(B16)细胞中所表达的GFP蛋白进行定位。 结果：琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,pDNA与壳聚糖之间通过静电作用而完全结合，制备的CS/pEGFP纳米粒为结构紧镦的不规则球形。应用DNaseI消化后可见,CS可保护核酸免受破坏。CS/pEGFP纳米粒能成功转染B16细胞和人胚肾(HEK293)细胞及活体动物，GFP的绿色荧光在细胞质和细胞核中均表达。 结论：壳聚糖可以有效凝聚pDNA,采用复凝聚法可制得200～400 nm范围,荷正电的纳米粒。本研究制备的CS/pEGFP纳米粒在体外和体内均能实现有效转染,为基因治疗提供了一种潜在的载体。