新的海葵神经毒素基因的克隆、功能表达及活性鉴定

摘要

根据已发现的海葵神经毒素Ap-B两端的氨基酸序列，设计筒并引物，用RT-PCR的方法，从采自湛江的侧花海葵Anthopleurln sp触手总RNA中分离出四个新的海葵毒素基因。将海葵神经毒素基因连接到融合表达载体pTRX的TrxA基因的3端，构建成符合读码框的融合表达质粒。融合表达质粒在工程菌BL21DE3中得到了高表达。经过镍亲和层析得到纯化的融合蛋白，融合蛋白经蛋白酶3C酶切后，过G50分子筛得到纯的重组海葵神经毒素。利用激光飞行时问质谱测定四个重组海葵神经毒素rHk2a，rHk7a，rHk8a，rHk16a的分子量分别为5078.5，4972.7，4993.0和5010.6，与根据氨基酸序列计算结果一致5kD。圆二色谱结果表明重组海葵神经毒素的二级结构与Ap-B相似，即重组海葵毒素折叠正确。 对大鼠高体心房增强收缩作用的研究表明，四种重组海葵神经毒素在正常K-H溶液和低钙K-H溶液中都可以增强心房收缩。其中rHK2a在低钙情况下具有最强的增强收缩能力，可使心房收缩增强10.38倍。rHK7a的作用时间最长，用药后240min仍然具有强心作用。