Flag与EGFP双标记表达质粒构建及在BK(ca)通道转运功能研究中的应用

摘要

目的：通过Overlapping PCR法构建Flag与EGFP双标记表达质粒pcDNA3.1-Flag-hBK-EGFP (Flag-hBK-EGFP),使用电生理、分子生物学和细胞生物学的方法研究该表达质粒在研究BKca通道转运功能中的应用.rn 方法：以pcDNA3.1-hBK为模板,使用Overlapping PCR分别将Flag标签插入到BKca通道胞外环S1-S2区域和EGFP连接到BKca通道的C端(胞内),构建Flag与EGFP双标记表达质粒Flag-hBK-EGFP.将Flag-hBK-EGFP通过脂质体转染至HEK-293细胞，构建稳定的表达系。进而使用膜片钳技术验证其电生理学特性，Westernblot检测其蛋白表达，激光共聚焦显微镜检测其在细胞中的定位，流式细胞术检测其在细胞膜上的表达(使用不透膜处理，荧光二抗检测Flag的荧光强度)及占细胞总表达量(GFP的荧光强度)的比例。rn 结果:表达质粒Flag-hBK-EGFP测序正确。 Westernblot能够检测到相应的蛋白表达，通道的电生理学特性与不带Flag和EGFP标签的基本一致;免疫荧光法能够检测到通道在细胞中的表达与定位，能够明显的看出通道在细胞膜上的表达。通过流式细胞术也能检测通道在细胞膜上的表达并能计算得到膜上的表达比例。rn 结论:成功构建稳定表达的Flag与EGFP双标记表达质粒Flag-hBK-EGFP的HEK-293细胞系，并具有不带标签的BKCa通道相似的电生理学特性，可以很好的用于通道蛋白转运研究。