无血清无饲养层培养体系在绵羊胚胎干细胞分离中的应用

摘要

目的：无血清无饲养层培养体系在绵羊胚胎干细胞分离中的应用。方法：将分离得到的若干oESC-like集落，在体式显微镜下将其放入Tryple Express中，观察这些集落由原来的致密状态逐渐松散呈草莓状后立即转入oESC培养液中充分洗涤，然后放入用矿物质油覆盖且平衡好的oESC基础培养基中，将其吹散至单个集落，再放入38.6℃, 5%CO2的饱和湿度的培养箱内培养，每3-5天传代一次。碱性磷酸酶与免疫荧光检测将收集的oESC-like一部分按Alkaline Phosphatase(AKP)试剂盒说明书对其进行染色检测。另一部分oESC-like进行免疫荧光检测。结果：通过机械分离法从84枚扩张阶段的囊胚中分离出31枚假定的绵羊ICM，ICM的分离数量显著高于早期阶段的囊胚。早期和扩张阶段囊胚经分离、传代后获得的oESC-like，经碱性磷酸酶染色后呈棕红色。而分化的胚胎干细胞的周边细胞呈弥散式生长，碱性磷酸酶活性降低，集落逐步呈平铺式生长，界限模糊。早期囊胚和扩张囊胚中分离获得的。ESC-like经过多潜能性候选基因Oct-4和Sox-2免疫荧光检测结果呈阳性，而荧光二抗的专一性检测作为阴性对照。同时本实验所分离获得的oESC-like在后期的体内外分化实验中形成神经细胞和畸胎瘤。结论：在成分明确的无血清无饲养层培养体系下，可以有效的分离获得未分化的oESC-like，并且对于在明确培养基上衍生绵羊类胚胎干细胞是第一次报告，同时扩张(孵化)阶段的囊胚对于分离且获得较多数量的oESC-like具有促进作用，从而可以降低对囊胚数量的要求。因此，这种成分明确的无血清无饲养层培养体系对于理解家畜ESC的衍生和特征提供了一个基础的参考。