猪胞内劳森菌定量PCR检测方法的建立与初步应用

摘要

为了建立用于检测导致猪增生性肠炎(PPE)的胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)的荧光定量PCR方法,依据GenBank中登录的LI基因组aspA序列,应用分子生物学软件优化设计1对特异性引物,经PCR扩增出300bp的目的片段.产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验.结果显示:建立的检测方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,r2=0.9979,产物TM在85.0～85.3℃之间,灵敏度为17.5个拷贝/μL,特异性和重复性较好,可用于临床PPE的诊断.本试验成功建立了检测PPE的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为LI的早期鉴别诊断以及PPE的致病机理研究提供了技术支持,也为PPE分子诊断试剂盒的研制奠定了技术基础.