猪胞内劳森氏菌LAMP、PCR快速检测方法的建立及应用

摘要

猪增生性肠炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于猪感染胞内劳森氏菌引起的一种传染性肠道出血性的消耗性疾病，1931年Bieste和Sohwarce首次报道了该病，1974年Rowland等证实了该病，该病现已成为世界上流行最广的猪病之一。虽然，猪增生性肠炎引起的死亡率不高，但由于其主要发病为慢性型，使得患病猪生长缓慢，饲料利用率和平均日增重明显下降，淘汰率上升，导致猪场经济损失严重。一些养猪业发达的国家和地区，由于饲料中抗生素的禁用或限用，导致猪增生性肠炎发病率逐年上升。在我国，临床猪增生性肠炎疑似病例有逐渐增多的趋势，但我国对猪增生性肠炎的研究还处于起步阶段，缺乏对该病的流行病学调查，因此开发快速准确的临床检测方法对于该病的研究具有重要的意义。
　　本试验根据引物设计原理，针对胞内劳森氏菌AM18025.2.1基因序列分别设计了PCR和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)特异性引物，通过对PCR方法退火温度的优化，LAMP方法的反应温度、反应时间、内外引物比例、dNTP浓度、镁离子浓度、甜菜碱的优化，确定其最优反应条件后成功建立了胞内劳森氏菌的PCR和LAMP两种检测方法。灵敏度实验结果表明建立的PCR方法可检出的拷贝数为103个，LAMP方法可检出的拷贝数为101个;特异性试验表明，PCR方法和LAMP方法对E.coli、Salmonella、PEDV、PRV扩增结果均为阴性，且这两种方法稳定性和重复性良好。LAMP反应产物还可进行可视化检测，阳性反应产物在自然光下出现明显浑浊，加入SYBR GreenⅠ染料后，在紫外灯照下，阳性反应管发出绿色荧光，而阴性反应管无荧光现象出现。
　　应用本试验建立的PCR和LAMP两种方法检测从四川部分规模化养猪场采集的114份粪便样本，其中60份样本(52.6％)利用PCR和LAMP检测方法均检出为阳性，13份样本(11.4％)利用LAMP检测方法检出为阳性，PCR检测方法检出为阴性，41份样本(36.0％)利用PCR和LAMP检测方法均检出为阴性。应用FIRSTtest试剂盒进行复核检测，PCR检测方法的符合率为76.0％，LAMP检测方法的符合率为92.4％，LAMP检测方法具有更高的灵敏度。
　　胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠炎造成的死亡率不高，但是对猪场的经济造成较大的损失，且该病目前在我国感染率较高。本试验所建立的PCR和LAMP两种方法具有快速简便的特点，且LAMP方法不需要复杂的仪器设备，反应条件简便，成本较低，适用于实验室和现场快速检测。本试验建立的PCR和LAMP方法为胞内劳森氏菌的检测提供了一定的参考。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations)

第一章 文献综述

1 猪增生性肠炎概述

1．1 病原学及其研究进展

1．2 流行病学及其研究进展

1．3 临床症状及病理变化

1．4 诊断方法

1．5 防治措施

2 环介导等温扩增技术

2．1 技术特点

2．2 技术原理

2．3 引物设计原则

2．4 LAMP反应体系

3 研究目的与意义

第二章 胞内劳森氏菌检测方法的建立

1 实验材料

1．1 实验材料

1．2 主要仪器

1．3 实验试剂

1．4 相关试剂配制

2 质粒模版的制备

2．1 胞内劳森氏菌质粒的制备

2．2 胞内劳森氏菌质粒浓度测定

2．3 粪便样品DNA的制备

2．4 其他细菌及病毒DNA或RNA的制备

3 胞内劳森氏菌检测方法的建立

3．1 引物的设计与合成

3．2 引物的验证

3．3 PCR产物克隆测序鉴定

3．4 LAMP反应条件的优化

3．5 PCR检测方法条件的优化

3．6 灵敏度试验

3．7 特异性试验

3．8 稳定性试验

3．9 临床应用试验

4 结果与分析

4．1 质粒模版测序以及浓度的测定

4．2 引物验证结果

4．3 LAMP反应条件的优化

4．4 LAMP反应条件的确立

4．5 胞内劳森氏菌LAMP可视化检测

4．6 PCR反应条件的优化及条件的确立

4．7 灵敏性试验

4．8 特异性试验

4．9 稳定性试验

4．10 临床样本检测

4．11 FISRTtestTM试剂盒检测

5 讨论

5．1 胞内劳森氏菌质粒模版的制备

5．2 建立方法的分析

5．3 反应条件对LAMP的影响

5．4 假阳性分析及应对措施

5．5 临床样本分析

第三章 试验创新点及结论

1 试验创新点

2 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录