鉴别猪伪狂犬病毒强弱毒的高效纳米PCR检测试剂盒及初步应用

摘要

本实验建立了鉴别猪伪狂犬病毒(PRV)强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒.根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB(431 bp)、gE(316 bp)和gG(202 bp)3个基因,用于区分PRV强毒与基因缺失毒株,优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒,对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验,并对临床样品进行了检测.特异性试验表明本试剂盒对于PRV能够扩增出431(gB)、316(gE)和202 bp(gG)的目的片段,对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431 bp和202 bp的目的片段,对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带,敏感性试验表明本试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100～1000倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到101拷贝/μL数量级.试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异,稳定性良好.-20℃至少可保存12个月.在对中国黑龙江、吉林等7个省份的临床送检的117份样品进行检测,检测结果显示PRV强毒阳性率为51％,阴性率为49％,未发现有弱毒感染.鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义,而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断.