诱导E14小鼠胚眙干细胞分化为小肠上皮细胞的研究

摘要

背景及目的：胚胎干细胞(ESC)可以在体外被定向诱导分化为三个胚层的多种细胞类型，但未见诱导胚胎干细胞分化为小肠上皮细胞的研究报道。本研究初步探讨肠道间质细胞原代培养上清联合表皮生长因子(EGF)、GlutaMAX-I及胰岛素是否能在体外诱导鼠ESC分化为小肠上皮细胞，并分析小肠问质细胞原代培养上清对ESC向小肠上皮细胞分化的影响。rn 方法：首先，进行小鼠小肠上皮细胞及间质细胞的分离和体外原代培养，收集问质细胞培养上清液，并以原代小肠上皮细胞作为实验阳性对照。然后，体外培养、扩增E14小鼠ESC细胞系，并将其在去除重组鼠白血病抑制因子后用悬滴法培养，使其形成拟胚体，在培养基(其中均含20%胎牛血清、2mmol/L GlutaMAX-I、20ng／mIEGF、100U/ml青、链霉素、2ug/ml胰岛素)分别体外培养16～21d。实验分为用添加和未加小肠间质细胞原代培养上清液两组。分别进行细胞形态学观察、Ck18的免疫荧光染色检测、AKP染色，应用RT-PCR检测Msi-1，Hes-1，Cdx-2，Ck19的mRNA转录水平。此外，将两种方案诱导分化的细胞接种的BABL/c裸鼠皮下，观察其在体内形成小肠黏膜细胞能力。rn 结果：经不同方案诱导的拟胚体，在1w左右的时间都可见上皮样细胞向周围生长2w左右加小肠间质细胞原代培养上清组(以下简称收集液组)的大部分分化细胞为上皮样细胞，细胞为圆形、多角形单层生长，胞浆丰富，核为圆形或卵圆形，核周可见许多小空泡；未添加小肠问质细胞原代培养上清组(以下简称非收集液组)的分化细胞中同时存在较多的成纤维细胞样细胞等杂细胞生长。继续观察到3w以后，细胞开始死亡、脱落。免疫荧光染色显示两组均有Ck18的表达。AKP染色显示收集液组分化的细胞中AKP染色阳性的细胞比例(26.9±2.5%)较非收集液组(1.2±0.9%)高(p<0.05)。RT-PCR显示收集液组和非收集液组的Msi-1和Hes-1基因表达无差别(p>0.05)，但两组基因表达量均高于原代小肠上皮细胞组(以下简称原代组)(p<0.05)：Cdx-2基因表达在非收集液组低于收集液组和原代组(p<0.05)，收集液组低于原代组(p<0.05)；原代组与非收集液组和收集液组的Ck19基因表达无差别(p>0.05)，而非收集液组低于收集液组(p<0.05)。将诱导的细胞接种到裸鼠皮下，3w后取出移植物，分别行HE染色和AKP染色。HE染色后观察到收集液组可见较多的管腔，管腔内面可见到明显的纤毛结构，有大量的柱状上皮细胞和杯状上皮细胞；非收集液组管腔结构较少，组织中可见多种细胞，如软骨细胞、骨细胞、肌细胞、腺上皮细胞等。AKP染色后观察，收集液组可见管腔内面棕黑色线样沉淀，为AKP阳性表现；非收集液组这种现象较少。rn 结论：培养体系中加入小肠间质细胞原代培养上清对在体外定向诱导ESC分化为小肠上皮细胞有一定的促进作用。