重叠延伸PCR

摘要： 鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实,采取分步扩增与DNA组装相结合的方式,提出一种长基因克隆解决方案。以克隆人表皮生长因子受体2基因为例,先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12,再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。从双片段连接物中筛选出上百个菌落,经检测和序列测定,得到一个序列完全准确的克隆。对于难以直接克隆的长基因,可先扩增其各个片段,再将它们拼接成完整基因。其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制,再辅以重叠延伸PCR融合法,即可实现多个基因片段的正确拼接。

摘要： PCR技术是现代分子生物学研究中最常用的技术,自1986年发明至今,在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多新PCR技术,本文对5种常用PCR技术进行简介.

摘要： 目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16°C诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。

摘要： 在功能基因组学时代,对基因的功能研究将涉及到大量的载体构建,为建立一种链霉菌外源基因多拷贝表达的载体构建方法,本研究采用重叠延伸PCR与双酶切结合的连接方法,构建链霉菌表达载体,以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)基因组DNA为模板,扩增红霉素合成相关的甲基化酶基因(erythromycin O-methyltransferase,eryG)和羟基化酶基因(erythromycin C-12 hydroxylase,eryK),以及启动子permE基因,采用重叠延伸PCR及EcoRⅤ、NotⅠ和XbaⅠ酶切位点相结合的连接方法构建含有多个基因片段的链霉菌重组表达载体.成功构建了携带外源基因的表达载体pSET001、pSET002和pSET003,最终获得含有多个基因的重组质粒.双酶切载体构建时载体或DNA片段上可用的限制性酶切位点受到限制,通过结合重叠延伸PCR技术,可以利用较少的内切酶快速构建含有多个基因片段的重组载体,为红霉素生产菌的改造提供了重组载体.

摘要： 重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题.此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒.若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒.以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物.故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒.两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性.该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案.

摘要： 使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对粘质沙雷氏菌菌株L1的脂肪酶(lipA)每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行预测、筛选,用重叠延伸PCR法构建了2个脂肪酶突变体lipA-Asn86Glu、lipA-Asn132Lys.经大肠杆菌表达和酶蛋白纯化后,对其酶学特性进行了表征.2个突变体和野生型的脂肪酶最适温度为30°C、最适pH值为8.与野生型相比,lipA-Asn86Glu的比酶活提高了8％,lipA-Asn132Lys的比酶活比野生型降低了19％;lipA-Asn86Glu在50°C下酶的半衰期与野生型相似,Km和Kcat值有所下降,而lipA-Asn132Lys的50°C时半衰期、Km和Kcat都明显降低.上述结果为通过理性设计突变位点对酶进行分子改造,以提高酶活力或热稳定性,提供了借鉴和途径.

摘要： 目的 构建3种常见的CD36基因突变质粒,为建立高分辨率熔解曲线方法 提供突变标准品.方法 选取广州人群常见的CD36基因突变位点A1237C、C268T及329-330delAC作为研究位点,采用重叠延伸PCR方法 及TA克隆技术构建含有上述突变位点的野生型和突变型质粒,并且对其进行测序验证.结果 DNA测序结果 证实构建的3种重组质粒分别含有CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变.结论 成功构建CD36基因A1237C、C268T、329-330delAC突变体标准质粒,为后续建立高分辨率熔解曲线方法 筛查CD36基因多态性奠定物质基础.

摘要： 为弥补传统标准物质的缺乏,构建了一种可用于筛查转基因作物成分的质粒标准分子.首先,通过PCR扩增获得454 bp的RBCL基因、236 bp的CaMV35S启动予以及200 bp的NOS终止子目的片段,经两次重叠延伸PCR扩增将上述3个片段连接成849 bp的重组子.随后,将该重组子克隆至pMD 18-T载体,经PCR扩增、测序分析后成功获得阳性重组质粒pMD-RBCL-CaMV35S-NOS.进一步的替代性研究显示,该重组质粒DNA与标准物质基因组DNA的检测分析结果一致.因此,该重组质粒标准分子可作为阳性标准物质用于转基因作物成分的初步筛查检测.

摘要： 脂肪酸合酶(FASN)是哺乳动物脂肪酸合成过程中的关键酶，它利用乙酰-COA、丙二酸单酰-CoA和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)催化饱和脂肪酸的合成，且与乳脂的分泌途径紧密相关。FASN在提高乳类的风味和品质方面具有重要作用，乳中的脂肪酸组成是影响乳品风味和品质的重要因素之一，因此对FASN进行调控,达到生产出高品质乳品的目标具有重要意义。本实验室前期研究已经克隆得到FASN启动子序列，并且通过缺失分析表明，FA SN核心启动子位于转录起始位点上游293bp区域内，启动子在线软件预测发现，该区域还有潜在的SRE(-150bp和-74bp处)、NF-Y(-100bp处)等转录因子结合位点。因此，本实验通过3个位点的定点突变研究其对FASN基因的转录调控作用。

摘要： 脂肪酸合酶(FASN)是哺乳动物脂肪酸合成过程中的关键酶，它利用乙酰-COA、丙二酸单酰-CoA和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)催化饱和脂肪酸的合成，且与乳脂的分泌途径紧密相关。FASN在提高乳类的风味和品质方面具有重要作用，乳中的脂肪酸组成是影响乳品风味和品质的重要因素之一，因此对FASN进行调控,达到生产出高品质乳品的目标具有重要意义。本实验室前期研究已经克隆得到FASN启动子序列，并且通过缺失分析表明，FA SN核心启动子位于转录起始位点上游293bp区域内，启动子在线软件预测发现，该区域还有潜在的SRE(-150bp和-74bp处)、NF-Y(-100bp处)等转录因子结合位点。因此，本实验通过3个位点的定点突变研究其对FASN基因的转录调控作用。

摘要： 脂肪酸合酶(FASN)是哺乳动物脂肪酸合成过程中的关键酶，它利用乙酰-COA、丙二酸单酰-CoA和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)催化饱和脂肪酸的合成，且与乳脂的分泌途径紧密相关。FASN在提高乳类的风味和品质方面具有重要作用，乳中的脂肪酸组成是影响乳品风味和品质的重要因素之一，因此对FASN进行调控,达到生产出高品质乳品的目标具有重要意义。本实验室前期研究已经克隆得到FASN启动子序列，并且通过缺失分析表明，FA SN核心启动子位于转录起始位点上游293bp区域内，启动子在线软件预测发现，该区域还有潜在的SRE(-150bp和-74bp处)、NF-Y(-100bp处)等转录因子结合位点。因此，本实验通过3个位点的定点突变研究其对FASN基因的转录调控作用。

摘要： 脂肪酸合酶(FASN)是哺乳动物脂肪酸合成过程中的关键酶，它利用乙酰-COA、丙二酸单酰-CoA和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)催化饱和脂肪酸的合成，且与乳脂的分泌途径紧密相关。FASN在提高乳类的风味和品质方面具有重要作用，乳中的脂肪酸组成是影响乳品风味和品质的重要因素之一，因此对FASN进行调控,达到生产出高品质乳品的目标具有重要意义。本实验室前期研究已经克隆得到FASN启动子序列，并且通过缺失分析表明，FA SN核心启动子位于转录起始位点上游293bp区域内，启动子在线软件预测发现，该区域还有潜在的SRE(-150bp和-74bp处)、NF-Y(-100bp处)等转录因子结合位点。因此，本实验通过3个位点的定点突变研究其对FASN基因的转录调控作用。

摘要： 为了研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂，本研究采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha，ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2，ChIL-2)的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-TEasy载体，将ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIFN-α在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rGhIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2病毒(AIVH9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。结果表明：成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kDa，蛋白经纯化后纯度在96％以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性，其抗VSV和IBDV(1.08×108IU/mg，1.61×105IU/mg)活性明显高于单-rChIFN-α的抗病毒活性(4.09×105IU/mg，1.99×104IU/mg);rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。干扰素活性单位为200IU的rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡、减轻NDV和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血，并能显著延长鸡胚存活时间，但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。iChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用，但对NDV活疫苗具有免疫抑制作用。以上结果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性，这为进一步研究以rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。

摘要： 为了研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂，本研究采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha，ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2，ChIL-2)的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-TEasy载体，将ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIFN-α在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rGhIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2病毒(AIVH9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。结果表明：成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kDa，蛋白经纯化后纯度在96％以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性，其抗VSV和IBDV(1.08×108IU/mg，1.61×105IU/mg)活性明显高于单-rChIFN-α的抗病毒活性(4.09×105IU/mg，1.99×104IU/mg);rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。干扰素活性单位为200IU的rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡、减轻NDV和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血，并能显著延长鸡胚存活时间，但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。iChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用，但对NDV活疫苗具有免疫抑制作用。以上结果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性，这为进一步研究以rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。

摘要： 为了研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂，本研究采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha，ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2，ChIL-2)的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-TEasy载体，将ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIFN-α在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rGhIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2病毒(AIVH9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。结果表明：成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kDa，蛋白经纯化后纯度在96％以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性，其抗VSV和IBDV(1.08×108IU/mg，1.61×105IU/mg)活性明显高于单-rChIFN-α的抗病毒活性(4.09×105IU/mg，1.99×104IU/mg);rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。干扰素活性单位为200IU的rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡、减轻NDV和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血，并能显著延长鸡胚存活时间，但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。iChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用，但对NDV活疫苗具有免疫抑制作用。以上结果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性，这为进一步研究以rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。

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摘要： 为了研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂，本研究采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha，ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2，ChIL-2)的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-TEasy载体，将ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIFN-α在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rGhIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2病毒(AIVH9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。结果表明：成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kDa，蛋白经纯化后纯度在96％以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性，其抗VSV和IBDV(1.08×108IU/mg，1.61×105IU/mg)活性明显高于单-rChIFN-α的抗病毒活性(4.09×105IU/mg，1.99×104IU/mg);rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。干扰素活性单位为200IU的rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡、减轻NDV和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血，并能显著延长鸡胚存活时间，但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。iChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用，但对NDV活疫苗具有免疫抑制作用。以上结果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性，这为进一步研究以rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。

摘要： 为了研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂，本研究采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha，ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2，ChIL-2)的成熟肽基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-TEasy载体，将ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白中的ChIFN-α在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rGhIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2病毒(AIVH9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。结果表明：成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kDa，蛋白经纯化后纯度在96％以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性，其抗VSV和IBDV(1.08×108IU/mg，1.61×105IU/mg)活性明显高于单-rChIFN-α的抗病毒活性(4.09×105IU/mg，1.99×104IU/mg);rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。干扰素活性单位为200IU的rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡、减轻NDV和AIV H9N2毒株所引起的胚体出血，并能显著延长鸡胚存活时间，但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。iChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白对NDV灭活疫苗具有显著的免疫增强作用，但对NDV活疫苗具有免疫抑制作用。以上结果表明rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性，这为进一步研究以rChIFN-α-tinker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种改进的重叠延伸PCR方法，本发明通过添加引物，在重叠延伸PCR过程中能利用引物进行指数扩增，有效提高克隆效率和插入片段的长度，如实施例1所示，传统方法无法获得目的克隆，而本发明方法克隆数提高约10倍的同时阳性率为50％；能在载体同一位置同时插入多个片段；能在载体不同位置同时插入、删除及置换多个片段。

摘要： 本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法，本方法一对用于重叠延伸PCR的全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本发明可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。

摘要： 本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测叶酸代谢相关基因突变的方法，一个用于检测叶酸代谢相关基因突变的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～8所示，利用本引物组合建立了本发明建立的检测方法，本发明利用重叠延伸PCR结合Sanger测序检测叶酸代谢相关基因位点单核苷酸多态性，整个过程仅需要一次PCR反应和一个测序反应，大幅度减少PCR反应数和测序反应数，就可以达到检测MTHFR和MTRR基因的与叶酸代谢相关的6个突变位点，并可以利用该方法发现扩增片段中新的变异位点。以此检测技术应用于叶酸代谢相关基因位点单核苷酸多态性检测具有重要的临床意义，不仅简化操作步骤，降低检测成本，而且提高检测效率，值得大力推广。

摘要： 本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法，本方法基于一个用于扩增

摘要： 本发明公开了一种新的基于重叠延伸PCR的载体构建方法：(1)根据目的基因和目的载体的序列设计第一轮PCR扩增引物对，上游引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之前的20～35bp同源臂序列，3’端部分为目的基因扩增特异引物；下游引物5’端部分为目的载体上目的基因插入位置之后的20～35bp同源臂序列，3’端部分为目的基因扩增特异引物；(2)用第一轮PCR扩增引物扩增目的基因；(3)回收第一轮PCR产物，以回收产物作为引物，以环形的目的质粒载体作为模板，进行第二轮PCR反应；(4)消化第二轮PCR产物；(5)取消化后的PCR产物转化大肠杆菌，摇菌提取质粒，鉴定得到含有目的基因的正确重组质粒。

摘要： 本发明公开了一种改进的重叠延伸PCR方法，本发明通过添加引物，在重叠延伸PCR过程中能利用引物进行指数扩增，有效提高克隆效率和插入片段的长度，如实施例1所示，传统方法无法获得目的克隆，而本发明方法克隆数提高约10倍的同时阳性率为50％；能在载体同一位置同时插入多个片段；能在载体不同位置同时插入、删除及置换多个片段。

摘要： 本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法，本方法一对用于重叠延伸PCR的全长扩增的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明通过一次PCR将不连续的位点连接成一条DNA片段，对这条包含多个检测位点所在片段，可以一次性进行Sanger测序分析，利用本发明可以将任意的2～4个包含各自检测位点的片段拼接连接形成融合片段，快速、简单，不需要限制性内切酶，中间无任何非目的基因的DNA序列，进而检测的检测突破了Sanger测序读长的限制，可以通过一个Sanger测序反应同时检测多个不连续的DNA位点。

摘要： 本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测叶酸代谢相关基因突变的方法，一个用于检测叶酸代谢相关基因突变的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～8所示，利用本引物组合建立了本发明建立的检测方法，本发明利用重叠延伸PCR结合Sanger测序检测叶酸代谢相关基因位点单核苷酸多态性，整个过程仅需要一次PCR反应和一个测序反应，大幅度减少PCR反应数和测序反应数，就可以达到检测MTHFR和MTRR基因的与叶酸代谢相关的6个突变位点，并可以利用该方法发现扩增片段中新的变异位点。以此检测技术应用于叶酸代谢相关基因位点单核苷酸多态性检测具有重要的临床意义，不仅简化操作步骤，降低检测成本，而且提高检测效率，值得大力推广。

摘要： 本发明公开了一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测耳聋易感基因突变的方法，本方法基于一个用于扩增

摘要： 本发明涉及一种基于重叠延伸PCR的抗结核药物耐药性检测方法，采用重叠延伸PCR法，在单管中将rpoB、embB、katG基因和inhA启动子的四个耐药相关片段连接扩增为一个约700bp长的融合片段，并只需一次测序反应得到四个片段的耐药突变信息，从而获知某结核分枝杆菌对三种一线抗结核药的耐药情况。该方法在临床上推广应用将极大地降低检测成本，减轻患者经济负担并产生良好的社会效益。简单来说，利用单管PCR扩增rpoB‑embB‑katG‑inhA融合片段进行测序从而检测抗结核一线三种药物耐药情况的方法，为临床耐药结核的检测减轻经济负担并提高检测准确性，方法简便，准确，成本低。